1.7.1.1. Thử nghiệm chẩn đoán nhanh (Quicktest)
Đây là một thử nghiệm miễn dịch phát hiện kháng nguyên của virút cúm, kháng thể đơn dòng có trong que thử kết hợp với kháng nguyên nucleoprotein (NP) của virút cúm.
Ưu điểm của thử nghiệm này là nhanh (cho kết quả trong vòng 15-20 phút), đơn giản, là một thử nghiệm khách quan có thể áp dụng cho bệnh phẩm lâm sàng hoặc hỗn dịch nuôi cấy virút. Tuy nhiên, nhược điểm của thử nghiệm này độ nhạy và độ đặc hiệu kém, một số bộ sinh phẩm không phân biệt được typ huyết thanh A hoặc B, không xác định được phân typ (H1, H3, H5...), giá thành cao (từ 12 USD – 25 USD/ 1 thử nghiệm). Theo tổng kết nghiên cứu của một số tác giả cho thấy độ nhạy trung bình 70 -75%, độ đặc hiệu trung bình 90- 99%; độ nhạy khi phát hiện virút cúm A cao hơn virút cúm B [21, 22].
Thử nghiệm này rất có hiệu quả trong sàng lọc và điều tra dịch cúm mùa ở người (cúm A/H1, H3, B...) nhưng không có giá trị trong việc phát hiện cúm A/H5N1 .
Hiện nay, trên thế giới có 10 bộ sinh phẩm chẩn đoán nhanh cúm trong đó 8 bộ do Mỹ và 2 bộ do Nhật Bản sản xuất bao gồm:
- Bộ sinh phẩm chỉ phát hiện cúm A: 1 bộ
- Bộ sinh phẩm phát hiện và phân biệt cúm A và B: 6 bộ
Directigen Flu A + B.
FLU OIA A/B.
XPECT FLU A/B.
NOW FLU A/B.
Capilia Flu A/B.
Influ A/B Quick.
- Bộ sinh phẩm phát hiện nhưng không phân biệt cúm A và B: 3 bộ
QuickVue Influenza Test.
FLU OIA.
ZstatFlu.
1.7.1.2. Phân lập và định týp virút
Yêu cầu về an toàn sinh học
Đối virút cúm mùa (cúm A/H3N2, A/H1N1, B...): việc phân lập virút phải được tiến hành trong phòng thí nghiệm an toàn cấp độ 2.
Đối với virút cúm gia cầm (cúm A/H5N1, H9N2...): là virút nguy hiểm mức độ 3 (theo phân loại của TCYTTG) nên việc phân lập virút phải được tiến hành trong phòng thí nghiệm an toàn sinh học cấp độ 3.
Phân lập virút được coi là “tiêu chuẩn vàng” trong giám sát cúm [22]. Chủng virút phân lập trong vụ dịch được nghiên cứu về các đặc điểm sinh học, sự biến đổi vật liệu di truyền và tính chất kháng nguyên để có thể dự báo được sự lan truyền của một chủng virút mới có độc lực cao trong giai đoạn tiếp theo và cho sự lựa chọn thành phần vắc xin cúm hàng năm.
Hiện nay, có 2 hệ thống phân lập được TCYTTG khuyến cáo là phân lập trên trứng gà đạt tiêu chuẩn (Specific Pathogenic Free - SPF) 10-11 ngày tuổi và trên dòng tế bào thường trực thận chó ( Mardin- Darby canine kidney cells - MDCK).
* Phân lập virút trên trứng: Virút cúm được phân lập đầu tiên trên trứng gà năm 1936. Sau khi cấy virút vào khoang niệu hoặc khoang ối, trứng được ủ ở 330
trong vòng 48h. Dịch niệu hoặc dịch ối thu được sau khi gặt trứng được kiểm tra hiệu giá bằng thử nghiệm ngưng kết hồng cầu gà 0,5% hoặc hồng cầu ngựa 1% [22]. Một số virút cúm A có thể phân lập trực tiếp bằng việc gây nhiễm vào khoang niệu nhưng cũng những chủng virút cúm A phải gây nhiễm trên dịch ối sau đó mới thích ứng lên khoang niệu trứng gà. Virút cúm A/H5N1 thường gây chết trứng sau 24h hoặc 48h gây nhiễm bệnh phẩm.
* Phân lập trên tế bào cảm thụ MDCK: Virút cúm có thể nhân lên trên các dòng tế bào tiên phát như tế bào thận khỉ, thận chuột đất, thận bê hoặc trên dòng tế bào thường trực như MDCK, Vero. MDCK là dòng tế bào thích hợp nhất để phân lập virút cúm trên người. Khi phân lập virút trên các dòng tế bào thường trực phải bổ sung trypsin (TPCK) – protease ngoại sinh. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng trypsin TPCK có ảnh hưởng tới sự phân tách phân tử HA thành HA1 và HA2, đóng vai trò quan trọng trong việc xâm nhập của virút vào tế bào cảm thụ. Tuy nhiên, đối với các dòng tế bào tiên phát thì protease là yếu tố nội sinh, vì vậy virút cúm vẫn có khả năng nhân lên mà không cần phải bổ sung trypsin trong quá trình nuôi cấy [88]. Ưu điểm của việc phân lập virút cúm trên tế bào là đơn giản, thuận tiện, có khả năng phân lập được một số lượng lớn mẫu bệnh phẩm. Tuy nhiên, tuỳ theo mục đích nghiên cứu để lựa chọn phương pháp phân lập. Phân lập trên trứng vẫn là lựa chọn tối ưu cho các nhà sản xuất vắc xin trên thế giới vì nó có khả năng khuếch đại một lượng lớn virút với hiệu giá cao [43, 89]. Tuy nhiên, việc sản xuất vắc xin trên tế bào MDCK và Vero cũng đang được nghiên cứu [16, 63].
* Định týp virút: virút sau khi phân lập được định týp ( xác định đặc tính kháng nguyên ) bằng phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu (HI).
1.7.1.3. Thử nghiệm miễn dịch huỳnh quang (Immunofluorescent assay - IFA)
Thử nghiệm miễn dịch huỳnh quang là kỹ thuật có hiệu quả trong chẩn đoán cúm. Tế bào cảm thụ sau khi gây nhiễm bệnh phẩm hoặc các tế bào biểu mô đường hô hấp trong bệnh phẩm lâm sàng (kháng nguyên) sẽ được rửa và cố định trên phiến kính. Kháng nguyên sau khi được cố định sẽ được gắn với các kháng thể đơn dòng
đặc hiệu týp và phân týp. Sau đó, kháng thể đơn dòng được phát hiện bằng kháng thể kháng IgG chuột gắn huỳnh quang FITC.
Thử nghiệm miễn dịch huỳnh quang là kỹ thuật nhanh và nhạy, được sử dụng thường xuyên trong các phòng thí nghiệm chẩn đoán vi sinh vật học. Nhưng kỹ thuật này đòi hỏi phải có chuyên gia trong việc thực hiện và đọc kết quả. Mặt khác, thử nghiệm miễn dịch huỳnh quang đòi hỏi phải sử dụng tế bào đã được gây nhiễm virrút cúm hoặc trực tiếp từ bệnh phẩm lâm sàng, đặc biệt với virút cúm A/H5N1, nên các bước tiến hành thử nghiệm phải được tiến hành trong phòng thí nghiệm an toàn sinh học bậc 3.