1.7.2.1. Phương pháp RT-PCR
Phương pháp RT-PCR (Reverse transcriptase – Polymerase chain reaction) đã được áp dụng và phát triển cho phần lớn các virút có vật liệu di truyền là ARN. Phương pháp này có khả năng xác định nhanh sự nhiễm virút thông qua xác định vật liệu di truyền của virút bằng khả năng phát hiện đoạn ARN đặc hiệu của virút cúm trong mẫu bệnh phẩm lâm sàng. Đây là phương pháp nhanh, nhạy, có độ đặc hiệu cao và chính xác khi được kiểm soát tốt.
Tuy nhiên, phương pháp này cũng có những hạn chế nhất định trong việc chẩn đoán sớm các trường hợp mắc bệnh do việc lựa chọn loại mẫu bệnh phẩm cũng như thời gian phù hợp để lấy mẫu. Phương pháp RT-PCR yêu cầu trang thiết bị và sinh phẩm với giá thành tương đối cao, khả năng dễ bị tạp nhiễm bởi tác nhân ngoại lai.
Cho tới nay, RT-PCR vẫn được coi là phương pháp tối ưu để phát hiện virút cúm, là một trong hai tiêu chuẩn trong chẩn đoán phòng thí nghiệm để khẳng định các trường hợp nhiễm cúm A/H5N1 theo qui định của TCYTTG.
1.7.2.2. Phương pháp Real time RT-PCR
Phương pháp Real time RT-PCR sử dụng cặp mồi và chất hóa học phát huỳnh quang hoặc probe có đánh dấu huỳnh quang (SYBR Green I, molecular
beacon, hybridization probe và Taqman probe) cho phép phát hiện chính xác số bản sao ADN của virút từ mẫu bệnh phẩm lâm sàng theo thời gian thật (real-time) [41, 57, 65]. Phương pháp Real time RT-PCR được ứng dụng để định lượng ADN, ARN, chẩn đoán các virút gây bệnh như virút cúm A/H5N1, RSV… [33, 35].
Phương pháp Real time RT-PCR không cần điện di sản phẩm như phương pháp RT-PCR thông thường nên phương pháp Real time RT-PCR được mô tả như một hệ thống “đóng”. Ưu điểm của phương pháp này là nhanh, nhạy, có độ chính xác và đặc hiệu cao, giảm thiểu nguy cơ tạp nhiễm [55]. Tuy nhiên, phương pháp Real time RT-PCR yêu cầu trang thiết bị và sinh phẩm với giá thành tương đối cao.
1.7.2.3. Phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt qua trung gian vòng phiên mã ngược (RT-LAMP)
Phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt qua trung gian vòng phiên mã ngược RT-LAMP (Reverse transcriptase – Loop - mediated isothermal amplification) là một phương pháp mới để khuếch đại ADN trong điều kiện đẳng nhiệt, do đó loại bỏ được sự thay đổi các chu kỳ nhiệt trong phương pháp RT-PCR thông thường. Phản ứng khuếch đại ADN thực hiện tại 630C trong 60 phút và cố định sản phẩm tại 800
C trong 2 phút trong hệ thống máy Loopamp-real time LA-200 (Kyoto – Nhật Bản). Vì vậy, thời gian tiến hành phản ứng sẽ được rút ngắn [79, 85]. Trong một phản ứng đã sử dụng 6 loại mồi bao gồm 2 mồi trong, 2 mồi ngoài và 2 mồi dạng vòng đã làm tăng độ nhạy của phản ứng. Phương pháp này có thể phát hiện virút cúm trong giai đoạn sớm của bệnh [74]. Tuy nhiên, độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp này cần được đánh giá thông qua một số lượng lớn mẫu thu thập ở bệnh nhân nhiễm cúm. Hiện nay, phương pháp này cũng đang được phát triển để chẩn đoán nhanh một số bệnh truyền nhiễm khác do virút như virút SARS-CoV, virút viêm gan B, virút viêm não Nhật Bản [122].
1.7.2.4. Phương pháp xác định trình tự gen
phân tích trình tự chuỗi tự động như ABI PRISM 3100 - Avant, BechmanCounter (Mỹ). Nguyên tắc của phản ứng dựa trên nguyên tắc của phương pháp Sanger có sử dụng các dideoxynucleotide. Mỗi loại dideoxynucleotide được đánh dấu bằng một chất huỳnh quang có màu khác nhau.
Sự xuất hiện của các dideoxynucleotide (các nucleotide mất gốc -OH ở vị trí cacbon 3' và được thay bằng -H, đã được đánh dấu huỳnh quang với các màu khác nhau) trong quá trình tổng hợp ADN bổ sung (mẫu gen cần giải trình tự ở dạng ADN sợi đơn) tạo ra những đoạn ADN có độ dài khác nhau. Những đoạn ADN này được điện di qua mao quản từ nhỏ đến lớn và các dideoxynucleotide được phát hiện bởi đầu đọc laser. Trình tự gen của mẫu chính là trình tự bổ sung các dideoxynucleotide được phát hiện bởi đầu đọc laser.
Phương pháp xác định trình tự gen xác định đặc điểm di truyền học, xây dựng cây gia hệ trên cơ sở so sánh gen HA, NA và M của virút cúm, từ đó xác định tần suất tiến hóa, các đột biến trên một số gen liên quan đến khả năng tăng độc lực của virút, giảm độ nhạy của thuốc kháng virút cũng như phát hiện các yếu tố tiềm tàng của sự trao đổi và tích hợp của virút cúm A/H5N1 và các chủng virút cúm đang lưu hành.
ADN sợi đơn
Thành phần: DNA polymerase I dATP dGTP dCTP dTTP
Trong qua trình điện di, đầu đọc laser sẽ thu được tín hiệu của các ddNTP Đoạn ADN lớn Đoạn ADN nhỏ Trình tự của mẫu ban đầu sẽ là ddATP ddGTP ddCTP ddTTP