V.1. Các phương pháp định tính phát hiện tính kháng khuẩn.
Phương pháp này cho ta thấy rõ phạm vi tác dụng và những hiểu biết sơ bộ về khả năng của loại kháng khuẩn tố đang cịn ở giai đoạn thơ .
V.1.1. Phương pháp trộn thuốc vào mơi trường thạch.[9].
Chất chiết được pha lỗng với dung dịch đệm cĩ nồng độ xác định. Dung dịch này trộn đều với mơi trường nuơi cấy, để ở nhiệt độ 480C – 500C, sau đĩ đổ ra từng hộp lồng với một lượng nhất định. Khi thạch đơng lại ta cấy các chủng vi sinh vật đã được chuẩn bị từ trước. Dùng que cấy vơ trùng lấy các chủng vi sinh vật gốc cấy lên trên mặt mơi trường thạch thành từng vạch thẳng. Để hộp lồng trong điều kiện thích hợp, từ 18 đến 20 giờ cho vi khuẩn mọc lên.
Chúng ta nhận định kết quả bằng sự quan sát vi khuẩn mọc thành từng khuẩn lạc, hay khơng mọc được so với mẫu đối chứng.
V.1.2. Phương pháp đục lỗ trong mơi trường thạch.[9].
Trong hộp lồng, đổ mơi trường thạch nĩng chảy, để đơng lại, sau đĩ cấy vi khuẩn đều khắp trên mặt. Dùng ống khoan lỗ cĩ kích thước quy định khoan vào thạch để tạo ra một lỗ trịn. Đổ mẫu thuốc cần nghiên cứu vào lổ trịn đĩ rồi để vào tủ ấm 370C sau 18 giờ.
Phương pháp này cho kết quả rõ ràng, do chất kháng khuẩn ngấm trực tiếp vào mơi trường.
V.1.3. Phương pháp thấm giấy.[9].
Giấy thấm cắt thành hình trịn cĩ đường kính khoảng 33.5 – 34.0 mm, sấy vơ trùng. Cho các mẫu giấy này thấm vào dung dịch cĩ chứa chất kháng khuẩn, rồi hong khơ. Đặt các giấy này lên mặt mơi trường thạch đã gieo cấy vi khuẩn, cất vào tủ ấm 370C sau 18 -20 giờ, đem ra đọc kết quả. Chỗ thạch cĩ chất kháng khuẩn ngấm ra, vi khuẩn khơng phát triển được.
Luận văn thạc sĩ
Phương pháp này chỉ thích hợp khi phát hiện loại vi khuẩn cĩ hoạt tính mạnh. Ngồi ra cịn ảnh hưởng khá nhiều đến lượng vi khuẩn cho vào mơi trường mỗi thí nghiệm khơng hằng định.
V.1.4. Phương pháp ống trụ của “Heatley”.[9].
Dùng hộp lồng cĩ đường kính 10 cm, đáy bằng, đổ vào khoảng 10 ml mơi trường thạch đã đun chảy, để cho đặc lại. Đun chảy một bình mơi trường thạch khác cĩ chứa 20 ml, chờ khi nhiệt độ mơi trường trở về 420C - 440C, cho vào 0.2 ml vi khuẩn đã cấy vào canh thang mọc tốt, trước đĩ 12 giờ, lắc đều mơi trường và vi khuẩn rồi đổ ra hộp thạch nĩi trên ở một lớp mỏng khoảng 4 ml. Lớp này sẽ đơng lại sau 10 – 15 phút. Đặt lên mặt lớp thạch những vịng kim loại khơng gỉ, vịng này cao 9.6mm, đường kính ngồi 7.2 mm, đường kính trong 5 mm, mỗi vịng kim loại cĩ khối lượng khơng nhẹ quá 1.7 gam để đảm bảo độ lún vào thạch. Đổ dung dịch cần nghiên cứu vào các vịng nĩi trên với nồng độ và khối lượng nhất định, rồi nhẹ nhàng để vào tủ ấm 370C khoảng 18 giờ. Sau thời gian này ta sẽ thấy vi khuẩn phát triển thành một màu trắng đục, đều khắp mặt mơi trường, cịn quanh vịng kim loại cĩ thể cĩ một vùng trong, vùng này chứng tỏ vi khuẩn khơng mọc được.
Phương pháp này rất thường dùng cho việc phát hiện tính kháng khuẩn, cĩ ưu điểm đảm bảo an tồn cho người thực hành kỹ thuật, ít bị nhiễm trùng, kết quả rõ ràng.
V.1.5. Phương pháp đào rãnh của Fleming (1932).[9].
Phương pháp này dùng để kiểm nghiệm tính kháng khuẩn của các giống điều chế ra Penixilin. Mơi trường thạch nấu chảy đổ vào các hộp lồng, chờ cho đơng lại, dùng dao nhỏ vơ trùng cắt hai đường song song gần giữa hộp ( hai đường này cách nhau 0.3 cm ), bỏ thỏi thạch ở giữa đi, đổ dung dịch thuốc định thử vào rãnh. Cấy vi khuẩn thành đường thẳng gĩc với rãnh. Để vào tủ ấm 370C khoảng 18 giờ. Đọc kết quả bằng cách đo vùng vơ khuẩn từ chân rãnh trở ra.
V.1.6. Phương pháp viên nén Đặng Văn Ngữ (1956).[9].
Các mẫu thuốc được nghiền nát, ép thành viên hình trụ, cao 0.8 cm, đường kính 1 –2 cm. Đặt những viên đĩ lên một hộp mơi trường thạch, đặt hộp này và tủ lạnh 40 C trong 6 giờ, để hoạt chất kháng khuẩn từ dược liệu khuếch tán vào mơi trường. Sau đĩ lấy ra, mở nắp hộp lồng đặt vào chuơng thủy tinh và Học viên Nguyễn Thị Bích Trâm Trang 43
Luận văn thạc sĩ
dùng một dụng cụ đặc biệt phun lên trên mặt mơi trường một lớp vi khuẩn, đậy nắp lại, để vào tủ ấm 370 C trong 12 -18 giờ. Đọc kết quả bằng cách đo vùng vơ khuẩn quanh viên nén.
Phương pháp này tránh được phải dùng nhiều vịng kim loại nhưng phải dùng những thiết bị cồng kềnh khác. Cũng cần phải rất thận trọng để tránh lây lan khi phải dùng những loại vi khuẩn độc để thí nghiệm.
V.1.7. Phương pháp thử những chất kháng khuẩn bay hơi.[9].
Phương pháp này được Rundat đề xuất lần đầu tiên khi nghiên cứu chất kháng khuẩn bay hơi từ hạt đu đủ.
Nội dung của phương pháp này là : dùng hai nữa hộp lồng cĩ đường kính bằng nhau, đổ mơi trường thạch nĩng chảy vào nữa hộp lồng phía đáy, để cho mơi trường đơng lại, cấy vi khuẩn thành từng đường thẳng. Nữa hộp lồng kia để các chất tinh dầu hay những thực vật cĩ chất bay hơi giã dập. Gắn khe hở bằng băng dính hoặc paraphin, để vào tủ ấm 370 C, sau 12 -18 giờ đọc kết quả, so sánh với đối chứng. Chất bay hơi cĩ tác dụng ức chế hoặc tiêu diệt vi sinh vật đem thử.
Phương pháp này cho phép phát hiện được những chất bay hơi mang tính kháng khuẩn mà các phương pháp kể trên khơng thể phát hiện được.
V.1.8. Phương pháp sắc ký kháng khuẩn.[9].
Việc phân tích kháng khuẩn tố ở giai đoạn đầu trong quá trình nghiên cứu bằng phương pháp sắc ký giấy được nhà bác học Ichida (80) áp dụng trước tiên, sau đĩ đã được nhiều người cải tiến thêm. Mặc dù cĩ rất nhiều tài liệu đề cập đến việc sử dụng phương pháp sắc ký trên giấy nhưng cho đến nay, vẫn chưa cĩ một quan điểm thống nhất về hệ thống hĩa các kháng khuẩn tố bằng phương pháp này.
Phương pháp tĩm tắt như sau : Chất đem thử được hịa tan trong dung mơi thích hợp, sau đĩ dùng loại dụng cụ đặc biệt để lấy chất thử, chấm nhiều lần vào một điểm trên giấy (loại giấy riêng biệt để làm sắc ký), đường kính của vết khơng quá 6 – 8 mm. Cho chạy thăm dị với từng hệ dung mơi trong một bình thủy tinh kín, đã được bão hịa trước tướng khơng di động. Trong sắc ký ngược, tờ giấy được giữ ở phía trên bình và thả đầu kia (đầu cĩ châm chất thử) xuống màng đựng tướng di động ngập tới 2 –3 cm, cách điểm chấm chất thử 3 – 4 cm. Cĩ thể dùng phương pháp sắc ký xuơi hoặc phương pháp sắc ký vịng. Sau khi đã chạy xong phần sắc ký, giấy được đuổi hết dung mơi và hong khơ. Đặt các Học viên Nguyễn Thị Bích Trâm Trang 44
Luận văn thạc sĩ
băng giấy trên mơi trường thạch đã cấy vi khuẩn, để ở nhiệt độ 370 C trong 12 giờ cho vi khuẩn phát triển ta sẽ được vùng vơ khuẩn ở vết sắc ký mang hoạt tính kháng khuẩn.
Phương pháp này cĩ ưu điểm tách biệt được chất kháng khuẩn ra khỏi nhiều chất khác. Xác định được chỉ số Rf của vết kháng khuẩn, cho phép ta đi sâu nghiên cứu thành phần và cấu trúc của chúng.
V.1.9. Phương pháp hiện đại của Vanden Benergher và Vlietlinck (1994).[12 ].
Phương pháp này tiến hành thử hoạt tính kháng vi sinh vật trên phiến vi lượng 96 giếng của các mẫu chiết theo 2 bước :
Bước 1 : Sàng lọc sơ bộ tìm chất chiết cĩ hoạt tính;
Bước 2 : Tìm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của chất cĩ hoat tính.
Nấm và vi khuẩn được duy trì trong mơi trường dinh dưỡng. Các chủng kiểm định được hoạt hĩa trước khi tiến hành thử nghiệm trong mơi trường dinh dưỡng dịch thể (24 giờ đối với vi khuẩn, 48 giờ đối với nấm).
Mẫu thử được hịa tan các chiết phẩm trong dung mơi Dimethyl sulfoxid (DMSO) 100%, với 4 – 10 thang nồng độ được pha lỗng từ dịch gốc rồi nhỏ sang phiến vi lượng 96 giếng. Vi sinh vật kiểm định sau khi được hoạt hĩa, pha lỗng bằng mơi trường dinh dưỡng cho tới nồng độ tương đương 0.5 đơn vị McLand (khoảng 108 vsv/ml). Để trong tủ ấm 370C trong thời gian 24 giờ đối với vi khuẩn và 300C trong thời gian 48 giờ đối với nấm. Sau đĩ đọc kết quả và tính giá trị ức chế tối thiểu (MIC).
Mẫu thơ cĩ MIC ≤ 200 µg/ml; mẫu tinh cĩ MIC ≤ 50µg/ml là cĩ hoạt tính
V.2. Các loại vi khuẩn, vi nấm sử dụng để xác định hoạt tính.[10],[11].
V.2.1. Vi khuẩn.
• Staphylococcus aureus :
- Là vi khuẩn Gram (+), khơng giáp mơ, khơng tạo bào tử.
- Sức đề kháng : nhạy cảm với Penicilin, Authromycin và Ampicilin. - Khả năng gây bệnh :
+ Sưng mủ trên da, niêm mạc, + gây ung nhọt, áp xe,
Luận văn thạc sĩ
+ viêm vú ở bị, cừu,
+ gây nhiễm trùng máu dẫn đến viêm phổi, viêm thận cấp, viêm tuyến sữa và viêm tủy xương.
• Bacillus subtilis :
- Là vi khuẩn Gram (+), trực khuẩn. - Là vi khuẩn cĩ lợi, cĩ mặt ở đường ruột. • Pseudomonas aeruginosa :
- Là vi khuẩn Gram (-), cĩ tiêm mao, vi khuẩn sinh sắc tố màu xanh.
- Khả năng gây bệnh :
+ Gây bệnh mủ xanh ở người và động vật, + viêm bàng quan, viêm tai cĩ mủ ở người. • E.coli:
- Là vi khuẩn Gram (-), khơng bào tử.
- Sức đề kháng : nhạy cảm với Chloramphenicol, Streptomycine, Sulfamid, Trimrthoprim.
- Khả năng gây bệnh : E.coli cĩ sẵn trong ruột, khi cơ thể bị suy yếu, sức đề kháng giảm thì E.coli mới gây bệnh :
+ Gây tiêu chảy,
+ bệnh phù thủng ở heo con, + viêm ruột.
• Enterococcus faecalis :
- Enterococcus là một phụ nhĩm của Streptococcus, nhĩm D. - Là vi khuẩn Gram (+), dạng cầu, khơng bào tử.
- Khả năng gây bệnh : trên da, đường tiêu hĩa, dạ dày, ruột và niệu sinh dục.
V.2.2. Nấm.
• Aspergillus :
- Là loại nấm mốc cĩ khả năng sinh độc tố gây ung thư là Aflatoxin. Học viên Nguyễn Thị Bích Trâm Trang 46
Luận văn thạc sĩ
- Đặc điểm hình dạng : hình bơng màu lục, cuống sinh bào tử.
+ Aspergillus flavus : thể bình, 1 hay 2 tầng trên cùng một bọng. Bơng hình phĩng xạ hay hình cột lỏng lẻo, cuống sinh bào tử.
+ Aspergillus oryzae : cuống sinh bào tử dài 1 – 2 mm. Thể bình hai lớp, khi già màu hơi nâu.
- Khả năng gây bệnh của Aflatoxin :
+ Ở gia súc : - Khi trúng độc cấp tính : chết đột ngột. - Khi trúng độc mãn tính : con vật kém ăn, chậm lớn, sụt cân.
- Khi nhiễm độc kéo dài : gây ung thư. + Ở người : gây ung thư.
• Trichoderma sp :
- Thuộc dạng vi nấm, sống trong mơi trường đất.
- Hình dạng : cĩ khuẩn ty khơng màu, cuống mang bào tử phân nhánh, ở cuối nhánh phát triển thành một khối trịn đính các bào tử trịn màu lục liên kết với nhau nhờ chất nhầy. Hình thức sinh sản bằng bào tử.
Luận văn thạc sĩ
Phần II :
THỰC NGHIỆM
Luận văn thạc sĩ
NỘI DUNG NGHIÊN CỨU :
Trên cơ sở Hesperidin, một flavonoid được chiết tách từ vỏ quít, chúng tơi tiến hành tổng hợp Hesperetin.Theo các tài liệu, Hesperidin và Hesperetin là những hợp chất cĩ hoạt tính sinh học cao, kháng nấm, kháng khuẩn tốt, là chất chống oxy hĩa mạnh. Bên cạnh Hesperidin và Hesperetin, chúng tơi cịn nghiên cứu tổng hợp Triacetyl Hesperetin-một hợp chất trung gian, để tiến hành tổng hợp các dẫn xuất của Hesperetin sau này.
Mục tiêu nghiên cứu của đề tài :
- Tách chiết Hesperidin, - Tổng hợp Hesperetin,
- Tổng hợp Triacetyl Hesperetin,
- Xác định hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của Hesperidin, Hesperetin và Triacetyl Hesperetin.
Với các nội dung trên, sơ đồ nghiên cứu như sau :
Luận văn thạc sĩ
Sơ đồ 1: Sơ đồ nghiên cứu
Học viên Nguyễn Thị Bích Trâm Trang 50 Lựa chọn nguyên
liệu (vỏ quít)
Xử lý nguyên liệu
Chiết tách Hesperidin
Tinh chế Hesperidin
Khảo sát quá trình tổng hợp Hesperetin
Tinh chế Hesperetin
Khảo sát quá trình tổng hợp Triacetyl Hesperetin
Tinh chế Triacetyl Hesperetin Định tính, định lượng Xác định cấu trúc Hoạt tính sinh học Xác định tính chất của sản phẩm Đánh giá tính chất, khả năng ứng dụng Hesperidin tinh Hesperetin tinh Triacetyl Hesperetin tinh
Luận văn thạc sĩ
A. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.
I. LỰA CHỌN XỬ LÝ NGUYÊN LIỆU.
Trong các lồi thực vật cĩ ở Việt Nam, cây quít cĩ hàm lượng Hesperidin cao, đặc biệt ở vỏ quít với hàm lượng trên 3.0% tính theo dược liệu khơ kiệt. Vì vậy chúng tơi chọn nguyên liệu chính là vỏ quít.
Sơ đồ 2 : Xử lý nguyên liệu.
Học viên Nguyễn Thị Bích Trâm Trang 51 Vỏ quít
Loại tạp
Nghiền mịn
Vỏ quít dạng bột
Luận văn thạc sĩ
II. TÁCH CHIẾT HESPERIDIN.
II.1. Phương pháp và điều kiện chiết Hesperidin.
Hesperidin là một hợp chất cĩ thể tan trong nhiều dung mơi, độ tan tăng dần trong các dung mơi sau:
+ Benzen + Chloroform + Nước + Aceton + Methanol + Dung dịch NaOH lỗng
Hesperidin tan tốt trong dung dịch NaOH lỗng. Tuy nhiên khi chiết Hesperidin từ bột vỏ quít bằng dung dịch NaOH lỗng bằng phương pháp ngâm dầm, tốn nhiều thời gian nhưng hiệu suất chiết khơng cao. Do đĩ chúng tơi chọn phương án chiết Hesperidin từ vỏ quít bằng dung mơi Methanol.
Điều kiện tiến hành
Chúng tơi chọn điều kiện tối ưu để tiến hành chiết tách Hesperidin như sau:
• Dụng cụ chiết : soxhlet.
• Chiết loại chất béo, chất màu :
+ Dung mơi : Ether dầu hỏa
+ Nhiệt độ chiết : nhiệt độ sơi của dung dịch. • Chiết Hesperidin :
+ Dung mơi : Methanol.
+ Nhiệt độ chiết : nhiệt độ sơi của dung dịch.
Luận văn thạc sĩ
Quy trình chiết :
Sơ đồ 3 :Quy trình chiết Hesperidin.
Học viên Nguyễn Thị Bích Trâm Trang 53 Bột vỏ quít
Chiết chất béo, chất màu
Lọc Dịch chiết
Methanol
(Thu hồi dung mơi)
Lọc Dịch chiết Chiết Hesperidin Lọc, rửa Hesperidin thơ bã Ether dầu hỏa
MeOH lạnh
Sấy Cắn MeOH
Luận văn thạc sĩ
II.2. Tinh chế Hesperidin.
.
Hesperidin chiết xuất được đem tinh chế và kết tinh nhiều lần trong Methanol.
Sơ đồ 4 : Quy trình tinh chế Hesperidin.
Học viên Nguyễn Thị Bích Trâm Trang 54 Hesperidin thơ Hịa tan Metanol Lọc nĩng Dịch lọc
Loại bớt dung mơi
Kết tinh Lọc, rửa Sấy Hesperidi n tinh Nước qua lọc Cặn Nước lạnh
Luận văn thạc sĩ
III. NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN TỔNG HỢP HESPERETIN
III.1. Điều kiện và quy trình tổng hợp.
Điều kiện tiến hành :
Chúng tơi chọn điều kiện tối ưu để tiến hành quá trình thuỷ phân Hesperidin thành Hesperetin như sau :
- Khối lượng nguyên liệu : 5 gam Hesperidin. - Lượng MeOH : 100 ml.
- Lượng H2SO4 96% : 5 ml.
- Nhiệt độ phản ứng : tsơi của dung dịch. - Thời gian phản ứng : 6 giờ.
- Quá trình thủy phân được khuấy liên tục.
Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của thời gian, lượng Methanol, acid H2SO4 96% lên khối lượng của sản phẩm phản ứng.
Luận văn thạc sĩ
Chúng tơi chọn quy trình tổng hợp Hesperetin như sau :
Sơ đồ 5 : Quy trình thủy phân Hesperidin thành Hesperetin.
Học viên Nguyễn Thị Bích Trâm Trang 56 Hesperidin
Thủy phân
Lọc
Thu hồi dung mơi Methanol H2SO4 96% Dd NaCl 15% Ethylacetat Sấy Hespereti n thơ rửa Nước cất Hỗn hợp dung dịch
Luận văn thạc sĩ
III.2. Tinh chế Hesperetin.
Hesperetin tổng hợp được đem tinh chế và kết tinh nhiều lần trong Ethanol.
Học viên Nguyễn Thị Bích Trâm Trang 57