V.1. Các phương pháp định tính phát hiện tính kháng khuẩn.
Phương pháp này cho ta thấy rõ phạm vi tác dụng và những hiểu biết sơ bộ về khả năng của loại kháng khuẩn tố đang còn ở giai đoạn thô .
V.1.1. Phương pháp trộn thuốc vào môi trường thạch.[9].
Chất chiết được pha loãng với dung dịch đệm có nồng độ xác định. Dung dịch này trộn đều với môi trường nuôi cấy, để ở nhiệt độ 480C – 500C, sau đó đổ ra từng hộp lồng với một lượng nhất định. Khi thạch đông lại ta cấy các chủng vi sinh vật đã được chuẩn bị từ trước. Dùng que cấy vô trùng lấy các chủng vi sinh vật gốc cấy lên trên mặt môi trường thạch thành từng vạch thẳng. Để hộp lồng trong điều kiện thích hợp, từ 18 đến 20 giờ cho vi khuẩn mọc lên.
Chúng ta nhận định kết quả bằng sự quan sát vi khuẩn mọc thành từng khuẩn lạc, hay không mọc được so với mẫu đối chứng.
V.1.2. Phương pháp đục lỗ trong môi trường thạch.[9].
Trong hộp lồng, đổ môi trường thạch nóng chảy, để đông lại, sau đó cấy vi khuẩn đều khắp trên mặt. Dùng ống khoan lỗ có kích thước quy định khoan vào thạch để tạo ra một lỗ tròn. Đổ mẫu thuốc cần nghiên cứu vào lổ tròn đó rồi để vào tủ ấm 370C sau 18 giờ.
Phương pháp này cho kết quả rõ ràng, do chất kháng khuẩn ngấm trực tiếp vào môi trường.
V.1.3. Phương pháp thấm giấy.[9].
Giấy thấm cắt thành hình tròn có đường kính khoảng 33.5 – 34.0 mm, sấy vô trùng. Cho các mẫu giấy này thấm vào dung dịch có chứa chất kháng khuẩn, rồi hong khô. Đặt các giấy này lên mặt môi trường thạch đã gieo cấy vi khuẩn, cất vào tủ ấm 370C sau 18 -20 giờ, đem ra đọc kết quả. Chỗ thạch có chất kháng khuẩn ngấm ra, vi khuẩn không phát triển được.
Luận văn thạc sĩ
Phương pháp này chỉ thích hợp khi phát hiện loại vi khuẩn có hoạt tính mạnh. Ngoài ra còn ảnh hưởng khá nhiều đến lượng vi khuẩn cho vào môi trường mỗi thí nghiệm không hằng định.
V.1.4. Phương pháp ống trụ của “Heatley”.[9].
Dùng hộp lồng có đường kính 10 cm, đáy bằng, đổ vào khoảng 10 ml môi trường thạch đã đun chảy, để cho đặc lại. Đun chảy một bình môi trường thạch khác có chứa 20 ml, chờ khi nhiệt độ môi trường trở về 420C - 440C, cho vào 0.2 ml vi khuẩn đã cấy vào canh thang mọc tốt, trước đó 12 giờ, lắc đều môi trường và vi khuẩn rồi đổ ra hộp thạch nói trên ở một lớp mỏng khoảng 4 ml. Lớp này sẽ đông lại sau 10 – 15 phút. Đặt lên mặt lớp thạch những vòng kim loại không gỉ, vòng này cao 9.6mm, đường kính ngoài 7.2 mm, đường kính trong 5 mm, mỗi vòng kim loại có khối lượng không nhẹ quá 1.7 gam để đảm bảo độ lún vào thạch. Đổ dung dịch cần nghiên cứu vào các vòng nói trên với nồng độ và khối lượng nhất định, rồi nhẹ nhàng để vào tủ ấm 370C khoảng 18 giờ. Sau thời gian này ta sẽ thấy vi khuẩn phát triển thành một màu trắng đục, đều khắp mặt môi trường, còn quanh vòng kim loại có thể có một vùng trong, vùng này chứng tỏ vi khuẩn không mọc được.
Phương pháp này rất thường dùng cho việc phát hiện tính kháng khuẩn, có ưu điểm đảm bảo an toàn cho người thực hành kỹ thuật, ít bị nhiễm trùng, kết quả rõ ràng.
V.1.5. Phương pháp đào rãnh của Fleming (1932).[9].
Phương pháp này dùng để kiểm nghiệm tính kháng khuẩn của các giống điều chế ra Penixilin. Môi trường thạch nấu chảy đổ vào các hộp lồng, chờ cho đông lại, dùng dao nhỏ vô trùng cắt hai đường song song gần giữa hộp ( hai đường này cách nhau 0.3 cm ), bỏ thỏi thạch ở giữa đi, đổ dung dịch thuốc định thử vào rãnh. Cấy vi khuẩn thành đường thẳng góc với rãnh. Để vào tủ ấm 370C khoảng 18 giờ. Đọc kết quả bằng cách đo vùng vô khuẩn từ chân rãnh trở ra.
V.1.6. Phương pháp viên nén Đặng Văn Ngữ (1956).[9].
Các mẫu thuốc được nghiền nát, ép thành viên hình trụ, cao 0.8 cm, đường kính 1 –2 cm. Đặt những viên đó lên một hộp môi trường thạch, đặt hộp này và tủ lạnh 40 C trong 6 giờ, để hoạt chất kháng khuẩn từ dược liệu khuếch tán vào môi trường. Sau đó lấy ra, mở nắp hộp lồng đặt vào chuông thủy tinh và Học viên Nguyễn Thị Bích Trâm Trang 43
Luận văn thạc sĩ
dùng một dụng cụ đặc biệt phun lên trên mặt môi trường một lớp vi khuẩn, đậy nắp lại, để vào tủ ấm 370 C trong 12 -18 giờ. Đọc kết quả bằng cách đo vùng vô khuẩn quanh viên nén.
Phương pháp này tránh được phải dùng nhiều vòng kim loại nhưng phải dùng những thiết bị cồng kềnh khác. Cũng cần phải rất thận trọng để tránh lây lan khi phải dùng những loại vi khuẩn độc để thí nghiệm.
V.1.7. Phương pháp thử những chất kháng khuẩn bay hơi.[9].
Phương pháp này được Rundat đề xuất lần đầu tiên khi nghiên cứu chất kháng khuẩn bay hơi từ hạt đu đủ.
Nội dung của phương pháp này là : dùng hai nữa hộp lồng có đường kính bằng nhau, đổ môi trường thạch nóng chảy vào nữa hộp lồng phía đáy, để cho môi trường đông lại, cấy vi khuẩn thành từng đường thẳng. Nữa hộp lồng kia để các chất tinh dầu hay những thực vật có chất bay hơi giã dập. Gắn khe hở bằng băng dính hoặc paraphin, để vào tủ ấm 370 C, sau 12 -18 giờ đọc kết quả, so sánh với đối chứng. Chất bay hơi có tác dụng ức chế hoặc tiêu diệt vi sinh vật đem thử.
Phương pháp này cho phép phát hiện được những chất bay hơi mang tính kháng khuẩn mà các phương pháp kể trên không thể phát hiện được.
V.1.8. Phương pháp sắc ký kháng khuẩn.[9].
Việc phân tích kháng khuẩn tố ở giai đoạn đầu trong quá trình nghiên cứu bằng phương pháp sắc ký giấy được nhà bác học Ichida (80) áp dụng trước tiên, sau đó đã được nhiều người cải tiến thêm. Mặc dù có rất nhiều tài liệu đề cập đến việc sử dụng phương pháp sắc ký trên giấy nhưng cho đến nay, vẫn chưa có một quan điểm thống nhất về hệ thống hóa các kháng khuẩn tố bằng phương pháp này.
Phương pháp tóm tắt như sau : Chất đem thử được hòa tan trong dung môi thích hợp, sau đó dùng loại dụng cụ đặc biệt để lấy chất thử, chấm nhiều lần vào một điểm trên giấy (loại giấy riêng biệt để làm sắc ký), đường kính của vết không quá 6 – 8 mm. Cho chạy thăm dò với từng hệ dung môi trong một bình thủy tinh kín, đã được bão hòa trước tướng không di động. Trong sắc ký ngược, tờ giấy được giữ ở phía trên bình và thả đầu kia (đầu có châm chất thử) xuống màng đựng tướng di động ngập tới 2 –3 cm, cách điểm chấm chất thử 3 – 4 cm. Có thể dùng phương pháp sắc ký xuôi hoặc phương pháp sắc ký vòng. Sau khi đã chạy xong phần sắc ký, giấy được đuổi hết dung môi và hong khô. Đặt các Học viên Nguyễn Thị Bích Trâm Trang 44
Luận văn thạc sĩ
băng giấy trên môi trường thạch đã cấy vi khuẩn, để ở nhiệt độ 370 C trong 12 giờ cho vi khuẩn phát triển ta sẽ được vùng vô khuẩn ở vết sắc ký mang hoạt tính kháng khuẩn. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Phương pháp này có ưu điểm tách biệt được chất kháng khuẩn ra khỏi nhiều chất khác. Xác định được chỉ số Rf của vết kháng khuẩn, cho phép ta đi sâu nghiên cứu thành phần và cấu trúc của chúng.
V.1.9. Phương pháp hiện đại của Vanden Benergher và Vlietlinck (1994).[12 ].
Phương pháp này tiến hành thử hoạt tính kháng vi sinh vật trên phiến vi lượng 96 giếng của các mẫu chiết theo 2 bước :
Bước 1 : Sàng lọc sơ bộ tìm chất chiết có hoạt tính;
Bước 2 : Tìm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của chất có hoat tính.
Nấm và vi khuẩn được duy trì trong môi trường dinh dưỡng. Các chủng kiểm định được hoạt hóa trước khi tiến hành thử nghiệm trong môi trường dinh dưỡng dịch thể (24 giờ đối với vi khuẩn, 48 giờ đối với nấm).
Mẫu thử được hòa tan các chiết phẩm trong dung môi Dimethyl sulfoxid (DMSO) 100%, với 4 – 10 thang nồng độ được pha loãng từ dịch gốc rồi nhỏ sang phiến vi lượng 96 giếng. Vi sinh vật kiểm định sau khi được hoạt hóa, pha loãng bằng môi trường dinh dưỡng cho tới nồng độ tương đương 0.5 đơn vị McLand (khoảng 108 vsv/ml). Để trong tủ ấm 370C trong thời gian 24 giờ đối với vi khuẩn và 300C trong thời gian 48 giờ đối với nấm. Sau đó đọc kết quả và tính giá trị ức chế tối thiểu (MIC).
Mẫu thô có MIC ≤ 200 µg/ml; mẫu tinh có MIC ≤ 50µg/ml là có hoạt tính
V.2. Các loại vi khuẩn, vi nấm sử dụng để xác định hoạt tính.[10],[11].
V.2.1. Vi khuẩn.
• Staphylococcus aureus :
- Là vi khuẩn Gram (+), không giáp mô, không tạo bào tử.
- Sức đề kháng : nhạy cảm với Penicilin, Authromycin và Ampicilin. - Khả năng gây bệnh :
+ Sưng mủ trên da, niêm mạc, + gây ung nhọt, áp xe,
Luận văn thạc sĩ
+ viêm vú ở bò, cừu,
+ gây nhiễm trùng máu dẫn đến viêm phổi, viêm thận cấp, viêm tuyến sữa và viêm tủy xương.
• Bacillus subtilis :
- Là vi khuẩn Gram (+), trực khuẩn. - Là vi khuẩn có lợi, có mặt ở đường ruột. • Pseudomonas aeruginosa :
- Là vi khuẩn Gram (-), có tiêm mao, vi khuẩn sinh sắc tố màu xanh.
- Khả năng gây bệnh :
+ Gây bệnh mủ xanh ở người và động vật, + viêm bàng quan, viêm tai có mủ ở người. • E.coli:
- Là vi khuẩn Gram (-), không bào tử.
- Sức đề kháng : nhạy cảm với Chloramphenicol, Streptomycine, Sulfamid, Trimrthoprim.
- Khả năng gây bệnh : E.coli có sẵn trong ruột, khi cơ thể bị suy yếu, sức đề kháng giảm thì E.coli mới gây bệnh :
+ Gây tiêu chảy,
+ bệnh phù thủng ở heo con, + viêm ruột.
• Enterococcus faecalis :
- Enterococcus là một phụ nhóm của Streptococcus, nhóm D. - Là vi khuẩn Gram (+), dạng cầu, không bào tử.
- Khả năng gây bệnh : trên da, đường tiêu hóa, dạ dày, ruột và niệu sinh dục. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
V.2.2. Nấm.
• Aspergillus :
- Là loại nấm mốc có khả năng sinh độc tố gây ung thư là Aflatoxin. Học viên Nguyễn Thị Bích Trâm Trang 46
Luận văn thạc sĩ
- Đặc điểm hình dạng : hình bông màu lục, cuống sinh bào tử.
+ Aspergillus flavus : thể bình, 1 hay 2 tầng trên cùng một bọng. Bông hình phóng xạ hay hình cột lỏng lẻo, cuống sinh bào tử.
+ Aspergillus oryzae : cuống sinh bào tử dài 1 – 2 mm. Thể bình hai lớp, khi già màu hơi nâu.
- Khả năng gây bệnh của Aflatoxin :
+ Ở gia súc : - Khi trúng độc cấp tính : chết đột ngột. - Khi trúng độc mãn tính : con vật kém ăn, chậm lớn, sụt cân.
- Khi nhiễm độc kéo dài : gây ung thư. + Ở người : gây ung thư.
• Trichoderma sp :
- Thuộc dạng vi nấm, sống trong môi trường đất.
- Hình dạng : có khuẩn ty không màu, cuống mang bào tử phân nhánh, ở cuối nhánh phát triển thành một khối tròn đính các bào tử tròn màu lục liên kết với nhau nhờ chất nhầy. Hình thức sinh sản bằng bào tử.
Luận văn thạc sĩ
Phần II :
THỰC NGHIỆM
Luận văn thạc sĩ
NỘI DUNG NGHIÊN CỨU :
Trên cơ sở Hesperidin, một flavonoid được chiết tách từ vỏ quít, chúng tôi tiến hành tổng hợp Hesperetin.Theo các tài liệu, Hesperidin và Hesperetin là những hợp chất có hoạt tính sinh học cao, kháng nấm, kháng khuẩn tốt, là chất chống oxy hóa mạnh. Bên cạnh Hesperidin và Hesperetin, chúng tôi còn nghiên cứu tổng hợp Triacetyl Hesperetin-một hợp chất trung gian, để tiến hành tổng hợp các dẫn xuất của Hesperetin sau này.
Mục tiêu nghiên cứu của đề tài :
- Tách chiết Hesperidin, - Tổng hợp Hesperetin,
- Tổng hợp Triacetyl Hesperetin,
- Xác định hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của Hesperidin, Hesperetin và Triacetyl Hesperetin.
Với các nội dung trên, sơ đồ nghiên cứu như sau :
Luận văn thạc sĩ
Sơ đồ 1: Sơ đồ nghiên cứu
Học viên Nguyễn Thị Bích Trâm Trang 50 Lựa chọn nguyên
liệu (vỏ quít)
Xử lý nguyên liệu
Chiết tách Hesperidin (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tinh chế Hesperidin
Khảo sát quá trình tổng hợp Hesperetin
Tinh chế Hesperetin
Khảo sát quá trình tổng hợp Triacetyl Hesperetin
Tinh chế Triacetyl Hesperetin Định tính, định lượng Xác định cấu trúc Hoạt tính sinh học Xác định tính chất của sản phẩm Đánh giá tính chất, khả năng ứng dụng Hesperidin tinh Hesperetin tinh Triacetyl Hesperetin tinh
Luận văn thạc sĩ
A. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.
I. LỰA CHỌN XỬ LÝ NGUYÊN LIỆU.
Trong các loài thực vật có ở Việt Nam, cây quít có hàm lượng Hesperidin cao, đặc biệt ở vỏ quít với hàm lượng trên 3.0% tính theo dược liệu khô kiệt. Vì vậy chúng tôi chọn nguyên liệu chính là vỏ quít.
Sơ đồ 2 : Xử lý nguyên liệu.
Học viên Nguyễn Thị Bích Trâm Trang 51 Vỏ quít
Loại tạp
Nghiền mịn
Vỏ quít dạng bột
Luận văn thạc sĩ
II. TÁCH CHIẾT HESPERIDIN.
II.1. Phương pháp và điều kiện chiết Hesperidin.
Hesperidin là một hợp chất có thể tan trong nhiều dung môi, độ tan tăng dần trong các dung môi sau:
+ Benzen + Chloroform + Nước
+ Aceton + Methanol
+ Dung dịch NaOH loãng
Hesperidin tan tốt trong dung dịch NaOH loãng. Tuy nhiên khi chiết Hesperidin từ bột vỏ quít bằng dung dịch NaOH loãng bằng phương pháp ngâm dầm, tốn nhiều thời gian nhưng hiệu suất chiết không cao. Do đó chúng tôi chọn phương án chiết Hesperidin từ vỏ quít bằng dung môi Methanol.
Điều kiện tiến hành
Chúng tôi chọn điều kiện tối ưu để tiến hành chiết tách Hesperidin như sau:
• Dụng cụ chiết : soxhlet.
• Chiết loại chất béo, chất màu :
+ Dung môi : Ether dầu hỏa
+ Nhiệt độ chiết : nhiệt độ sôi của dung dịch. • Chiết Hesperidin :
+ Dung môi : Methanol.
+ Nhiệt độ chiết : nhiệt độ sôi của dung dịch. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Luận văn thạc sĩ
Quy trình chiết :
Sơ đồ 3 :Quy trình chiết Hesperidin.
Học viên Nguyễn Thị Bích Trâm Trang 53 Bột vỏ quít
Chiết chất béo, chất màu
Lọc Dịch chiết
Methanol
(Thu hồi dung môi)
Lọc Dịch chiết Chiết Hesperidin Lọc, rửa Hesperidin thô bã Ether dầu hỏa
MeOH lạnh
Sấy Cắn MeOH
Luận văn thạc sĩ
II.2. Tinh chế Hesperidin.
.
Hesperidin chiết xuất được đem tinh chế và kết tinh nhiều lần trong Methanol.
Sơ đồ 4 : Quy trình tinh chế Hesperidin.
Học viên Nguyễn Thị Bích Trâm Trang 54 Hesperidin thô Hòa tan Metanol Lọc nóng Dịch lọc
Loại bớt dung môi
Kết tinh Lọc, rửa Sấy Hesperidi n tinh Nước qua lọc Cặn Nước lạnh
Luận văn thạc sĩ
III. NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN TỔNG HỢP HESPERETIN
III.1. Điều kiện và quy trình tổng hợp.
Điều kiện tiến hành :
Chúng tôi chọn điều kiện tối ưu để tiến hành quá trình thuỷ phân Hesperidin thành Hesperetin như sau :
- Khối lượng nguyên liệu : 5 gam Hesperidin. - Lượng MeOH : 100 ml.
- Lượng H2SO4 96% : 5 ml.
- Nhiệt độ phản ứng : tsôi của dung dịch. - Thời gian phản ứng : 6 giờ.
- Quá trình thủy phân được khuấy liên tục. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của thời gian, lượng Methanol, acid H2SO4 96% lên khối lượng của sản phẩm phản ứng.
Luận văn thạc sĩ
Chúng tôi chọn quy trình tổng hợp Hesperetin như sau :
Sơ đồ 5 : Quy trình thủy phân Hesperidin thành Hesperetin.
Học viên Nguyễn Thị Bích Trâm Trang 56 Hesperidin
Thủy phân
Lọc
Thu hồi dung môi Methanol H2SO4 96% Dd NaCl 15% Ethylacetat Sấy Hespereti n thô rửa Nước cất Hỗn hợp dung dịch
Luận văn thạc sĩ
III.2. Tinh chế Hesperetin.
Hesperetin tổng hợp được đem tinh chế và kết tinh nhiều lần trong Ethanol.
Học viên Nguyễn Thị Bích Trâm Trang 57