- Tiến hành pha Skoog I, II và III của mơi trường MS Pha stock vitamin Morel, glycin và inosytol
ENZYM POLYPHENOLOXYDAZA
3.1. Nguyên tắc :
Khi cho một lượng axít ascorbic tác dụng với pyrocatechin với sự cĩ mặt của enzym polyphenoloxydaza thì phản ứng sẽ xảy ra trước hết tạo thành orthoquinon. Sau đĩ orthoquinon là chất oxy hố mạnh tác dụng với axít ascorbic. Căn cứ vào lượng axít ascorbic tiêu tốn trong phản ứng sẽ suy ra hoạt tính của enzym. Phương trình phản ứng như sau :
Pyrocatechin Polyphenoloxydaza Orthoquinon + H2O Orthoquinon + axít ascorbic → Pyrocatechin + axit dehidroascorbic
3.2. Chiết tách enzym Polyphenoloxydaza.
Cân 2-5 g thực vật tươi (lá chè, hạt cacao tươi,...), cắt thành mảnh nhỏ
bỏ vào cối sứ nghiền nhanh với axeton khan và 0,5 g Al2O3. Gạn dung dịch chiết qua phễu thuỷ tinh xốp số 2, cịn cặn tiếp tục nghiền, lọc khoảng 5-6 lần cho đến khi chlorophyll hồn tồn được tách hết. Lúc đĩ ta nhận được loại bột màu vàng nhạt, đĩ là chế phẩm enzym-axeton.
3.3. Cách tiến hành và tính tốn kết quả.
- Cách tiến hành :
Cân chính xác 50 mg chế phẩm enzym-axeton vào bình nĩn 100 ml, cho thêm 10 ml dung dịch đệm phosphat pH =7, thêm 2 ml dung dịch axít ascorbic 0,2% vừa mới pha và 1 ml dung dịch pyrocatechin 0,5 %. Lắc mạnh trong đúng 2 phút ở nhiệt độ 20 0C.
Khử hoạt tính enzym bằng cách thêm 2 ml dung dịch H2SO4 10 %. Tiếp tục thêm vào phản ứng một vài tinh thể KI và 5 giọt hồ tinh bột 1 %.
Tiếp tục chuẩn độ lượng axit ascorbic cịn lại bằng dung dịch KIO3
0,001N đến khi xuất hiện màu xanh bền.
Song song với thí nghiệm thực, tiến hành thí nghiệm trắng bằng cách thêm các hố chất theo thứ tự : 50 mg chế phẩm enzym-axeton vào bình nĩn 100 ml, thêm 10 ml dung dịch đệm phosphat pH=7, thêm 2 ml dung dịch H2SO4 10 %, Lắc mạnh đúng 2 phút ở 20 0C. Tiếp tục thêm 2 ml axit ascorbic 0,2 % vừa mới pha và 1 ml dung dịch pyrocatechin 0,5 %. Thêm vài tinh thể
67
KI và 5 giọt hồ tinh bột 1 % rồi chuẩn độ lượng axit ascorbic bằng dung dịch KIO3 0,01N đến khi xuất hiện màu xanh bền.
- Tính kết quả : Hoạt độ enzym polyphenoloxydaza được thể hiện bằng hiệu số giữa số ml dung dịch KIO3 0,01N ở mẫu trắng và mẫu thí nghiệm trong 1g chế phẩm enzym-axeton, được tính theo cơng thức sau :
χ = C . t 1000 ). b a ( −
Trong đĩ : χ là hoạt độ enzym polyphenoloxydaza trong 1gam chế
phẩm trong 1 phút
a là số ml KIO3 0,01N chuẩn độở mẫu trắng b là số ml KIO3 0,01N chuẩn độở bình thí nghiệm 1000 là hệ số chuyển ra gam
C là khối lượng mẫu chế phẩm enzym-axeton t là thời gian thí nghiệm - phút.
- Dụng cụ và hố chất :
Cân điện tử, cối chày sứ, phễu xốp số 2, máy hút chân khơng, buret 10 ml, pipet 1 ml, pipet 2 ml, bình nĩn 100 ml, tủ lạnh.
Al2O3, axeton khan, axit ascorbic 0,2 %, pyrocatechin 0,5 %, axit sunphuric 10 %, KI tinh thể, dung dịch KIO3 0,01N.
68
BÀI 1