- Tiến hành pha Skoog I, II và III của mơi trường MS Pha stock vitamin Morel, glycin và inosytol
XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ AMYLAZA DỰA VÀO LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ TẠO THÀNH.
LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ TẠO THÀNH.
2.1. Chiết tách dịch enzym.
Tiến hành giống nhưở phần 1.1 của bài 1 ở trên.
2.2. Xác định hoạt độ amylaza theo phương pháp Nelson.
- Nguyên tắc : Sau khi cho enzym thuỷ phân tinh bột ở những điều kiện xác định, đun hỗn hợp phản ứng với dung dịch đồng (II), tạo thành kết tủa Cu2O.
Hồ tan kết tủa trong thuốc thử arseno-molypden sẽ nhận được màu xanh da trời. So màu ở bước sĩng 660nm, đối chiếu với đồ thị tiêu chuẩn để
tính lượng đường.
- Đơn vị hoạt độ enzym là lượng enzym mà trong 30 phút ở 300C cĩ thể
phân giải tinh bột tạo thành lượng đường khử tương ứng với 1 micromol glucoza.
2.3. Cách tiến hành và tính kết quả :
- Chuẩn bị 2 ống nghiệm khơ, sạch, cho vào mỗi ống 0,5 ml dung dịch enzym cĩ độ pha lỗng thích hợp. Cho vào ống thứ 1 (ống kiểm tra) 1 mol thuốc thử 5 và 0,5 ml dung dịch tinh bột 1 %. Ống thứ 2 (ống thí nghiệm) đặt vào tủ ấm 30 0C trong 10-15 phút. Thêm 0,5 ml dung dịch tinh bột 1 % (đã
đạt 30 0C) lắc đều, giữ đúng 30 phút ở 30 0C. Sau đĩ cho 1 ml thuốc thử 5 lắc
đều. Đặt cả 2 ống nghiệm vào nồi cách thuỷ đang sơi trong 20 phút rồi lấy ra làm nguội dưới vịi nước chảy. Thêm vào mỗi ống 1 ml thuốc thử arseno- molypden, lắc liên tục cho đến khi ngừng tạo thành bọt khí CO2 và hồ tan hồn tồn kết tủa Cu2O. Thêm nước cất đến 10 ml. Lắc đều, so màu ở bước sĩng 660 nm đối với mẫu trắng.
Mẫu trắng : Cho 1 ml nước cất, 1 ml thuốc thử 5, đun sơi 20 phút trong nồi cách thuỷ đang sơi, làm lạnh, thêm 1ml thuốc thử arseno-molypden và tiếp tục làm như trên.
- Tính kết quả : Lấy hiệu số đọc trên máy giữa mẫu thí nghiệm và mẫu kiểm tra (ETN - EKT). Đối chiếu với đồ thị tiêu chuẩn để tính ra số micromol glucoza tương ứng, nhân với độ pha lỗng dung dịch enzym, tính số đơn vị
65
- Hố chất :
1- Dung dịch enzym : chuẩn bị giống như phần 1.1 của bài 1.
2- Dung dịch tinh bột 1 % trong dung dịch đệm phosphat 0,05M pH = 6.0. 3- Thuốc thử đồng (I) : Hồ tan 200 g Na2SO4 khan hoặc 356 g
Na2SO4.10H2O vào 600 ml nước cất đang sơi. Chuẩn bị 100 ml dung dịch cĩ chứa 25g muối Seignet. Cho cả hai dung dịch trên vào bình
định mức 1 lít. Thêm vào 20 g NaHCO3 và 25 g Na2CO3 khan (hoặc 50 g tinh thể). Sau khi hồ tan thêm nước cất vào đến vạch. Nếu dung dịch
đục cần phải lọc. Giữ dung dịch ở 30-37 0C. Nếu sau đĩ dung dịch cĩ tinh thể cần phải đun cách thuỷ nhẹ trước khi dùng.
4- Thuốc thử đồng (II) : Hồ tan 15 g CuSO4.5H2O trong ít nước cất, thêm 1-2 giọt H2SO4đặc, thêm nước cất đến 100 ml.
5- Thuốc thử hỗn hợp : Trộn lẫn thuốc thử đồng (I) và (II) theo tỷ lệ 25:1 ngay trước khi dùng.
6- Thuốc thử arseno-molypden : Hồ tan 25 g molypdat amonium trong 400 ml nước cất, thêm 31 ml H2SO4 đặc. Chuẩn bị 25 ml dung dịch cĩ chứa 3 g Na2HAsO4.7H2O. Trộn lẫn 2 dung dịch trên giữ ở 30-37 0C trong 24-48 h hoặc ở 55 0C trong 24 phút trong lọ cĩ màu nâu để dung dịch cĩ màu vàng bền.
7- Dung dịch glucoza tiêu chuẩn : Trong 1 ml chứa 1 µM glucoza, từ dung dịch này chuẩn bị các dung dịch cĩ chứa 0,20; 0,25; 0,30; 0,40; 0,50; 0,60 µM trong 1ml. Lấy 1ml dung dịch cho vào ống nghiệm thêm 1ml thuốc thử 5, đun sơi 20 phút trong nồi cách thuỷ, làm lạnh, thêm 1ml thuốc thử arseno-molypden, lắc đều, so màu.
66
BÀI 3