- Tiến hành pha Skoog I, II và III của mơi trường MS Pha stock vitamin Morel, glycin và inosytol
XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ α-AMYLAZA THEO PHƯƠNG PHÁP HEINXEL
PHƯƠNG PHÁP HEINXEL
1.1. Chiết tách dịch enzym từ chế phẩm nấm mốc và từ malt.
Cân 20-100 g mơi trường nuơi cấy bề mặt (chế phẩm nấm mốc) hoặc malt, nghiền nhỏ cẩn thận, cho vào bình tam giác, thêm 500-1000 ml dung dịch NaCl 1%, đặt trên máy lắc liên tục trong 1-2 h. Lọc hoặc ly tâm ở 6000 vịng/phút đểđược dung dịch enzym trong suốt.
1.2. Nguyên tắc :
Xác định lượng tinh bột bị phân giải dựa trên cơ sở xác định mức độ
giảm cường độ màu của hỗn hợp phản ứng với dung dich iốt.
Đơn vị hoạt độ ezim là lượng enzym cĩ khả năng phân giải 1mg tinh bột sau 30 phút ở 30 0C.
1.3. Cách tiến hành và tính kết quả :
Cho vào ống nghiệm 1mg dung dịch tinh bột 1%, 1 mg dung dịch NaCl 0,1% và 2 ml dung dịch đệm phosphat 0,05M pH 6.0, lắc đều, giữ ở 30 0C trong 15-20 phút để dung dịch đạt đến 30 0C. Thêm vào hỗn hợp 1 ml dung dịch enzym đã đạt đến 30 0C. Lắc đều, tiếp tục giữ ở 30 0C đúng 30 phút lấy
ống nghiệm ra khỏi tủ ấm, cho ngay vào 5 ml dung dịch axít sunfosalisilic 20 % để làm ngừng phản ứng sau vài phút lọc.
Song song với mẫu thí nghiệm làm mẫu kiểm tra cũng tương tự như
trên nhưng cho dung dịch axít sunfosalisilic vào trước rồi mới cho dung dịch enzym.
Lấy 1ml dịch lọc của mẫu thí nghiệm cũng như mẫu kiểm tra cho vào
ống nghiệm, thêm 9 ml dung dịch iốt pha lỗng 150 lần. So màu ở bước sĩng 560 nm. Lấy hiệu số số đọc trên máy giữa mẫu kiểm tra và thí nghiệm, đối chiếu với đường cong tiêu chuẩn, tính số mg tinh bột đã bị phân giải.
Hố chất sử dụng : - Dung dịch NaCl 0,1%
- Dung dịch axít sunfosalisilic 20%
- Dung dịch iốt : hồ tan 1g iốt vào 5ml dung dịch cĩ chứa 2 g KI, thêm nước cất vào đến 300ml. Khi dùng pha lỗng dung dịch này 150 lần. - Dung dịch đệm phosphat 0,05 M pH = 6.0
63
- Dung dich tinh bột 1% trong dung dịch đệm phosphat 0,05 M pH = 6.0. Cân 1g tinh bột trộn với khoảng 10ml dung dịch đệm, thêm vào 80ml dung dịch đệm đang sơi, để nguội, thêm dung dich đệm vào cho đến 100ml.
Để bảo quản dung dịch tinh bột cĩ thể thêm 1g benzoat natri.
- Dung dịch tinh bột tiêu chuẩn 1% : Cân 1 g tinh bột trộn với 10 ml nước cất, thêm 80 ml nước cất đang sơi, khuấy đều và nếu cần tiếp tục
đun để nhận được dung dịch trong suốt, để nguội cho vào bình định mức 100 ml và thêm nước cất đến vạch mức.
Từ dung dịch này chuẩn bị các dung dịch cĩ chứa 2, 4, 6, 8 và 10 mg tinh bột trong 1 ml bằng cách lấy 2, 4, 6, 8 ml dung dịch tinh bột 1% và thêm nước cất vào cho đến 10 ml.
Lập đồ thị tiêu chuẩn : Lấy 0,1 ml dung dịch tinh bột đã chuẩn bị như
trên, thêm 0,1 ml dung dịch NaCl 0,1 %; 0,2 ml dung dịch đệm; 0,1 ml nước cất; 0,5 ml dung dịch axít sunfosalisilic 20%, lắc đều, thêm 9 ml dung dịch iốt
đã pha lỗng 150 lần, so màu ở bước sĩng 560 nm. Vẽ đồ thị tiêu chuẩn, trên trục hồnh ghi số mg tinh bột, trục tung ghi sốđọc được trên máy tương ứng.
64
BÀI 2