Để thiết kế c ặp mồi cho gen M, chúng tôi đã download 139 trình tự nucleotide gen M của virus cúm A, trong đó bao gồm đa ̣i diê ̣n của hầu hết các subtype (H1-H16 và N1-N9) đã đươ ̣c công bố trên GenBank . Các chủng virus được phân lập ở các đối tượng khác nhau như gà, gà tây, vịt, ngỗng, mòng biển, chim cút, người, môi trường... Các trình tự này được so sán h bằng phần mềm ClustalX 2.0.11, phân tích kết quả so sánh bằng phần mềm BioEdit và FastPCR 5.4. Sau khi tiến hành các bước như trên , chúng tôi đã lựa chọn cặp mồi để khuếch đại t rình tự đặc hiê ̣u trên gen M của các chủng virus cúm A trong bảng 3.1:
Bảng 3.1: Cặp mồi phát hiện gen M của virus cúm A
Tên mồi Trình tự 5’-3’ Vị trí Tm %GC
DiagMF GTCTTCTAACCGAGGTCGAAAC 5-26 55.1 50 DiagMR GTGACAGGATTGGTCTTGTCTT 158-139 55.8 45.5
Cặp mồi này có trình tự trùng khớp với hầu hết các chủng virus cúm A đã download. Một số chủng virus cúm A có sự khác biệt ở 1 - 2 nucleotide, tuy nhiên các nucleotide này đều nằm ở đầu 5’ hoă ̣c ở giữa trình tự nên ít ảnh hưởng đến khả năng gắn mồi vào khuôn đích (hình 3.1).
Phân tích trên PastPCR cho thấy, mồi xuôi (DiagMF) và mồi ngược (DiagMR) phát hiện gen M có kích thước 22 nucleotide. Cặp mồi này có nhiệt độ biến tính Tm tương đương nhau khoảng 55oC, không có hiện tượng bắt cặp bổ sung giữa các nucleotide trong bản thân mỗi mồi. Mồi xuôi và mồi ngược chỉ cặp bổ sung nhau tạo dimer ở giá trị độ nhạy cho phát hiện dimer là 1, tuy nhiên sự bắt cặp là lỏng lẻo và các nucleotide ở đầu 3’ không bắt cặp nhau. Cặp mồi khuếch đại đoạn DNA đích trên gen M của virus cúm A có kích thước là 154 bp.
Cặp mồi được Primer - Blast với các trình tự DNA của virus cúm có trên ngân hàng dữ liệu gene của NCBI cho kết quả đăc hiệu trên gen M của tất cả các subtype của virus cúm A, các đoạn được khuếch đại đều có kích thước 154 bp.