Cách lấy mẫu:
- Mẫu ngoáy họng hoặc mẫu ổ nhớp: Đưa tăm bông mềm vào vùng ho ̣ng hoă ̣c ổ nhớp của gia cầm , ngoáy kỹ vùng định lấy mẫu . Nếu lấy mẫu ngoáy ho ̣ng , cần đưa đầu tăm bông vào đến khí quản để lấy được di ̣ch trong đường hô hấp . Sau đó đưa đầu tăm bông vào tu be chứa 3 ml môi trường vâ ̣n chuyển và nh úng kỹ trong môi trường vâ ̣n chuyển . Nhấc đầu tăm bông lên khỏi môi trường , ép nhẹ vào thành tube để lươ ̣ng di ̣ch còn la ̣i ở đầu tăm bông xuống hết.
- Mẫu mô: Đối với gia cầm chết hoặc bị bệnh , tiến hành mổ gia cầm và thu thâ ̣p mẫu mô (phổi, khí quản, ruô ̣t...) và cho vào tu be chứa môi trường vâ ̣n chuyển virus.
Bảo quản mẫu: Các mẫu bệnh phẩm sau khi thu thập được bảo quản bằng đá lạnh và v ận chuyển về phòng thí nghiệm ngay trong vòng 48 giờ. Nếu không v ận chuyển đươ ̣c mẫu về phòng thí nghiệm trước 48 giờ thì bảo quản ở -20o
C hoặc -70oC. Khi vận chuyển, mẫu vẫn giữ ở trạng thái đông băng.
Vận chuyển mẫu về phòng thí nghiệm:
Bê ̣nh phẩm trước khi vâ ̣n chuyển được đóng gói kỹ trong 3 lớp nhằm bảo vê ̣ bê ̣nh phẩm trong quá trình vâ ̣n chuyển : Vă ̣n chă ̣t nắp tube bê ̣nh phẩm , bọc kỹ miê ̣ng tube bằng giấy parafi n, bọc riêng từng tube bệnh phẩm bằng giấy thấm , đă ̣t tube vào túi nylon vâ ̣n chuyển , buô ̣c chă ̣t . Tiếp tu ̣c bo ̣c bên ngoài túi vâ ̣n chuyển bằng giấy thấm hoă ̣c bông thấm nước , cho vào mô ̣t túi nylon khác và buô ̣c chă ̣t . Phiếu thu thâ ̣p bê ̣nh phẩm được cho cùng với túi bê ̣nh phẩm vào lớp túi nylon thứ 3, buô ̣c chă ̣t . Cho các tú i bê ̣nh phẩm đã đóng gói kỹ vào hô ̣p bảo quản la ̣nh và vâ ̣n chuyển về phòng thí nghiê ̣m.
2.2.3. Tách chiết RNA mẫu bệnh phẩm
Xử lý mẫu
- Đối với mẫu mô: Mẫu bệnh phẩm thu thâ ̣p trên gia cầm đươ ̣c cho vào tube 2 ml có nắp xoáy, bổ sung 1 ml nước tinh sa ̣ch và glass bead, lắc trên máy lắc trong 5 phút để phá vỡ tế bào và giải phóng virus. Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút và thu lấy di ̣ch nổi để tách chiết RNA.
- Đối với mẫu ngoáy ho ̣ng và ngoáy hậu môn được cho v ào tu be có chứa dung di ̣ch vâ ̣n chuyển virus . Các mẫu được lắc kỹ bằng vortex , ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút, thu di ̣ch nổi để tách chiết RNA.
Tách chiết RNA
Sử du ̣ng 0.14 ml di ̣ch nổi bệnh phẩm đã xử lý để tách chiết RNA bằng bô ̣ sinh phẩm QIAamp viral RNA mini spin protocol.
Trước khi tách chiết, kiểm tra và chuẩn bị các loại hóa chất theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Và các bước tách chiết như sau:
- Hút 560 μl dung di ̣ch buffer AVL/Carrier RNA vào tube ly tâm 1.5 ml.
- Thêm 140 μl bê ̣nh phẩm đã đư ợc xử lý vào tube chứa buffer AVL/Carrier RNA. Trộn kỹ bằng vortex trong 15 giây.
- Để ở nhiê ̣t đô ̣ phòng (15-25°C) trong 10 phút để virus bị phân giải hoàn toàn, ly tâm nhẹ để tâ ̣p trung dung di ̣ch xuống đáy tube .
- Thêm 560 μl ethanol (96-100%) vào tube, trộn bằng vortex trong 15 giây, ly tâm nhe ̣ để tâ ̣p trung dung di ̣ch xuống đáy tube.
- Hút 630 μl dung di ̣ch ở trên chuyển vào QIAamp spin column (đã đă ̣t sẵn trong tube 2 ml), cẩn thận tránh để ướt m iê ̣ng tube. Đóng chă ̣t nắp và ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút. Nhấc QIAamp spin column ra đă ̣t column vào mô ̣t tube 2 ml mớ i và vứt bỏ tube cũ.
- Hút số dịch còn lại vào QIAamp spin column rồi ly tâm và chuyển QIAamp spin column sang tube 2 ml mới.
- Bổ sung 500 μl buffer AW1 và ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút. Đặt QIAamp spin column vào tube 2 ml khác và vứt bỏ tube cũ.
- Đặt QIAamp spin colu mn vào 1 tube ly tâm 1.5 ml, vứt bỏ tube c ũ. Bổ sung 60 μl buffer AVE. Đóng chă ̣t nắ p, để ở nhiệt độ phòng trong 1 phút. Ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút.
RNA có thể bền vững trong vòng 1 năm khi bảo quản ở –20°C hoă ̣c –70°C.
2.2.4. Thiết kế mồi
Mồi là những đoạn oligonucleotide dài khoảng 18-30 nucleotide có trình tự bổ sung với hai đầu của đoạn DNA muốn khuếch đại. Mồi có vai trò khởi động enzyme DNA polyemerase để kéo dài chuỗi DNA đích và quyết định hiệu quả và độ chính xác của phản ứng PCR.
mồi. Các mồi thiết kế phải đặc hiệu với các gen đặc trưng cho đối tượng cần xác định. Để chẩn đoán virus cúm A/H5N1, chúng tôi tiến hành thiết kế 3 cặp mồi phát hiê ̣n 3 trình tự đặc hiệu trên 3 gen M, HA và NA bao gồm:
- Cặp mồi khuếch đa ̣i trình tự nucleotide đă ̣c hiê ̣u trên g en M của tất cả các subtype của virus cúm A.
- Cặp mồi khuếch đa ̣i trình tự nucleotide đă ̣c hiê ̣u trên gen HA của virus cúm A subtype H5 và không khuếch đại trình tự nucleotide tương đương với các subtype HA khác.
- Cặp mồi khuếch đa ̣i trình tự nucleotide đă ̣c hiê ̣u trên gen NA của virus cúm A subtype N1 và không khuếch đại trình tự nucleotide tương đương vớ i các subtype NA khác
Các cặp mồi được thiết kế dựa trên trình tự gen M, HA và NA của các chủng virus cúm A/H5N1 đã công bố trên Genbank theo các nguyên tắc nhất định về: kích thước mồi từ 18-30 nucleotide; nhiệt độ biến tính các mồi (Tm) tương đương nhau; tỷ lệ GC trong mồi từ 40-60%; trình tự nucleotide của mồi đặc hiệu với khuôn; tránh bắt cặp bổ sung của 2 hoặc nhiều hơn các nucleotide tại đầu 3’ của các mồi để giảm sự hình thành primer-dimer; các nucleotide ở đầu 3’ của mồi bắt cặp hoàn toàn đặc hiệu với trình tự đích để giảm thiểu tối đa hiện tượng bắt cặp sai; tránh 3 hoặc nhiều hơn G hoặc C tại đầu 3’ liền nhau; tránh trình tự bắt cặp bổ sung bên trong mỗi mồi và giữa các mồi; chọn vị trí mồi sao cho kích thước các đoạn DNA đích nhân lên trong phản ứng multiplex RT-PCR phân biệt được trên bản điện di. Để thiết kế mồi, chúng tôi sử dụng các phần mềm chuyên dùng cho thiết kế mồi đó là FastPCR5.4, BioEdit, Clustalx2.0.11. Các bước thiết kế các cặp mồi đặc hiệu các gen M, HA và NA như sau:
+ Mở trang web của NCBI (National Center for Biotechnology Information)
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/Database/request.cgi), lựa cho ̣n các thông tin cần thiết về: loài virus (virus cúm A), vâ ̣t chủ (bất kỳ), khu vực (bất kỳ), các gen cần download (M, HA và NA), thờ i gian lưu hành, subtype (H5N1),...
+ Download các trình tự nucleotide của các gen M, HA và NA của virus đã đươ ̣c công bố trên GenB ank dưới da ̣ng FASTA file . Các chủng virus chọn để thiết kế mồi được phân lập từ nhiều đối tượng khác nhau.
+ Tiến hành so sánh các trình tự nucleotide bằng phần mềm Clustal X 2.0.11 + Phân tích kết quả so sánh bằng phần mềm BioEdit , lựa chọn các đoạn trình tự có đô ̣ lă ̣p la ̣i cao để thiết kế mồi cho các gen.
+ Phân tích các trình tự có đô ̣ lă ̣p la ̣i cao bằng phần mềm FastPCR 5.4 để lựa chọn các trình tự m ồi đặc hiê ̣u sử du ̣ng được trong cùng một phản ứng multiplex RT-PCR chẩn đoán cúm A/H5N1.
+ Kiểm tra độ đặc hiệu của các cặp mồi đã chọn bằng Primer - Blast với các trình tự DNA của virus cúm có trên ngân hàng dữ liệu gene của NCBI.
Cặp mồi thiết kế phát hiện gen M được lựa chọn từ những vùng bảo tồn trên gen M của các subtype virus cúm A khác nhau. Trong khi đó, các mồi phát hiện gen H5 và N1 được lựa chọn từ những vùng không thay đổi (ít bị đột biến) trên các trình tự gen HA và NA của virus cúm A subtype H5N1.
2.2.5. Tối ƣu phản ứng RT-PCR phát hiện từng gen M, HA và NA
Sau khi thiết kế được các cặp mồi, chúng tôi thực hiện phản ứng RT-PCR vớ i từng că ̣p mồi riêng rẽ để xác định các điều kiện (nồng đô ̣ mồi, nhiê ̣t đô ̣ và thời gian gắn mồi, thời gian kéo dài chuỗi, số chu kỳ lă ̣p la ̣i) thích hợp nhất để phát hiện được từng gen M, HA và NA của virus cúm A/H5N1. Phản ứng RT-PCR được thực hiện với bô ̣ sinh phẩm Qiagen Onestep RT-PCR, trên máy luân nhiê ̣t C 1000 (Biorad). Theo bộ sinh phẩm này, cả hai giai đoạn phiên mã ngược tạo cDNA (phản ứng RT) và giai đoạn khuếch đại (phản ứng PCR) được thực hiện trong cùng một tube phản ứng, nghĩa là sau khi cho RNA tách chiết vào tube, phản ứng phiên mã ngược sẽ được thực hiện trước nhờ enzyme Omniscript and Sensiscrip Reverse Transcriptases và tiếp đến phản ứng PCR nhờ enzyme Hot Star Taq DNA polymerase. Như vậy, tất cả các thành phần của phản ứng RT và PCR được cho vào một tube phản ứng trong cùng một lần. Thể tích của mỗi phản ứng RT-PCR thử nghiệm là 50 l bao gồm các thành phần trong bảng 2.1:
Bảng 2.1: Các thành phần của phản ứng RT-PCR
Thứ tự Sinh phẩm Thể tích (l) Nồng độ cuối
1 RNase free water 2 Qiagen Onestep RT-PCR
buffer 5X
10 1X
3 dNTP mix 10 mM each 2 0.4 mM each
4 Primer forward 10 M 5 Primer reverse 10 M 6 Qiagen Onestep RT-PCR Enzyme mix 2 7 RNase Inhibitor 40 U/l 5 – 10 U
8 RNA của A/H5N1 1 pg - 2 g
Tổng cô ̣ng 50
Chu trình nhiệt của phản ứng (bảng 2.2):
Bảng 2.2: Chu trình nhiệt của phản ứng RT-PCR
Thứ tự Các bước Thời gian
(phút)
Nhiệt độ (oC)
1 Phiên mã ngược (RT) 30 50
2 Hoạt hoá Hot Star Taq DNA polymerase, ức chế enzyme phiên mã ngược, biến tính
cDNA ban đầu
15 95 3 Biến tính cDNA 0.5 94 4 Gắn mồi 0.5-1 51-60 5 Kéo dài 0.5-1 72 6 Số chu kỳ 35-50 7 Hoàn thiện 5 72
Sản phẩm DNA khuếch đại được phát hiện bằng điện di trên gel agarose 2%, nhuộm dung dịch ethidium bromide 0.5 µg/ml 15 phút. Gel được chụp ảnh và phân tích kết quả. Kích thước các vạch DNA được so sánh với thang DNA chuẩn 100 bp.
Tối ưu nhiệt độ gắn mồi:
Muốn mồi có thể bắt cặp hoàn toàn đặc hiệu trên sợi khuôn thì phải xác định được nhiệt độ gắn mồi (Ta- annealing temperature) tối ưu cho từng cặp mồi. Nhiệt độ bắt cặp mồi tối ưu có thể nhỏ hơn hoặc lớn hơn nhiệt độ biến tính mồi (Tm - melting temperature). Bắt đầu tối ưu nhiệt độ gắn mồi ở nhiệt độ nhỏ hơn Tm mồi khoảng 4-5oC. Chúng tôi lựa chọn dải nhiệt độ 51oC đến 60oC để thử nghiệm tìm ra nhiệt độ gắn mồi tối ưu cho mỗi cặp mồi.
Tối ưu nồng độ mồi:
Mồi là một chỉ tiêu quan trọng của phản ứng PCR để quyết định tính đặc trưng và hiệu quả của phản ứng. Nồng độ mồi thấp sẽ ảnh hưởng đến hiệu quả bắt cặp, sẩn phẩm khuếch đại thấp. Ngược lại, nồng độ mồi quá cao sẽ hình thành những bắt cặp không đặc hiệu trên các vị trí khác nhau của mẫu và xuất hiện các primer - dimer, làm giảm sản phẩm PCR của các đoạn cần khuếch đại. Để tìm được nồng độ mồi tối ưu cho mỗi phản ứng RT-PCR với từng cặp mồi đã thiết kế, chúng tôi thử nghiệm ở các nồng độ 0.3 µM, 0.4 µM, 0.5 µM; 0.6 µM; 0.7 µM; 0.8 µM và 0.9 µM.
Tối ưu thời gian gắn mồi và kéo dài chuỗi:
Thời gian kéo dài chuỗi phụ thuộc vào enzyme DNA polymerase, chiều dài sản phẩm và loại template. Thời gian kéo dài thử nghiệm ở 30 giây, 45 giây và 60 giây để xác định thời gian kéo dài chuỗi thích hợp nhất ở mỗi chu trình nhiệt của từng phản ứng.
Thời gian gắn mồi cũng được lựa chọn kiểm tra ở 30 giây, 45 giây và 60 giây.
Tối ưu số chu kỳ phản ứng RT-PCR:
Để phân tích được bằng điện di, thì sản phẩm PCR phải đạt lượng nhất định. Số chu kỳ của phản ứng quá thấp sẽ không đủ để tạo ra tín hiệu có thể phát hiện, còn số chu kỳ quá cao có thể làm xuất hiện các sản phẩm không đặc hiệu và tốn nhiều thời gian đối với các xét nghiệm cần chẩn đoán nhanh. Trung bình số chu kỳ phản ứng khoảng 25-30 chu kỳ, nhưng trong phản ứng RT-PCR số chu kỳ phụ
thuộc vào nồng độ mẫu RNA cao hay thấp và lượng sản phẩm cDNA của phản ứng phiên mã ngược. Để có số chu kỳ thích hợp cho mỗi phản ứng RT-PCR phát hiện từng riêng rẽ, chúng tôi kiểm tra số lượng chu kỳ là 35, 40, 45 và 50 chu kỳ.
Đánh giá độ nhạy của phản ứng RT-PCR phát hiện từng gen M, HA và NA:
Độ nhạy của phản ứng RT-PCR là số bản copy RNA nhỏ nhất mà phản ứng PCR cho kết quả dương tính. Để đánh giá độ nhạy của mỗi phản ứng RT-PCR, chúng tối sử dụng các gen HA , NA và M của chủng virus cúm A /H5N1 gắn vào plasmid pJET 1.2/blunt (Fermentas) tạo plasmid tái tổ hợp theo bộ sinh phẩm CloneJET™ PCR Cloning Kit. Các bước như sau:
- Gắn các gen M, HA, NA vào vector pJET1.2/blunt (2974 bp): Làm tan đông sản phẩm PCR , các sinh phẩm trong bộ kit C loneJet PCR Cloning và đă ̣t trên đá bào. Hút 6 l (Nuclease free water), 10 l (2X reaction buffer), 1 l (sản phẩm PCR), 1 l (DNA blunting enzyme) vào tube PCR 0.2 ml, vortex và ly tâm nhẹ trong 3-5 giây. Sau đó ủ ở 70oC trong 5 phút r ồi đặt ngay lê n đá la ̣nh . Tiếp theo, thêm vào mỗi tube PCR 1 l (pJET 1.2/blunt cloning vector – 50 ng/l) và 1 l (T4 DNA ligase - 5 u/l), vortex và ly tâm nhẹ trong 3-5 giây rồi để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Sản phẩm phản ứng được sử dụng trực tiếp để biến nạp vào vi khuẩn E.coli.
- Tạo tế bào khả biến: Sau khi gắn trình tự gen của virus cúm A /H5N1 vào plasmid pJET 1.2, để nhân lượng plasmid thì cần phải biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào E.coli TOP10 và nuôi cấy tế bào để plasmid có thể nhân lên với số lượng lớn. Để tế bào E .coli có thể dung na ̣p plasmid , chúng tôi tạo tế bào E.coli khả biến bằng phương pháp CaCl2 để làm cho vi khuẩn E .coli trở nên khả biến . Các bước: Nuôi tế bào E .coli trong 2 ml LB lỏng, lắc 200 vòng/phút ở 37oC qua đêm. Sau đó cấy chuyển 40 l di ̣ch cấy tế bào sang tube chứa 2 ml LB, lắc 200 vòng/phút ở 37oC trong 2 giờ rồi để trên đá 10 phút, ly tâm 4000 vòng/phút trong 5 phút ở 4oC. Hút bỏ dịch nổi, thu lấy cặn. Bổ sung 1 ml CaCl2 100 mM (để ở 4oC từ trước). Tiếp theo ly tâm 4000 vòng/phút trong 5 phút ở 4o
C, hút bỏ dịch nổi, thu lấy cặn . Bổ sung một
và 30 l glycerol. Trộn đều, chia vào các tube , mỗi tube 50 l. Giữ trên đá 1-2 giờ trước khi biến na ̣p (hoă ̣c đông la ̣nh bằng nitơ lỏng và bảo quản ở -85oC).
- Biến nạp DNA plasmid vào tế bào khả biến: Lấy tế bào khả biến từ -85oC, để trên đá 30 phút (hoă ̣c sử du ̣ng tế bào khả biế n vừa chuẩn bi ̣). Bổ sung 5 l hỗn hơ ̣p lai vào 50 l tế bào khả biến, để trên đá 30 phút. Sốc nhiê ̣t ở 42oC trong 2 phút, sau đó đă ̣t ngay lên đá b ào trong 2 phút. Bổ sung 200 l LB lỏng, lắc 200 vòng/phút ở
37oC trong 1 giờ . Trải dịch nuôi trên môi trường thạch LB có bổ sung Ampicillin (100 g/ml), nuôi ở 37oC qua đêm.
- Tách chiết plasmid với GeneJET Plasmid Miniprep Kit : Lấy 1 khuẩn lạc riêng rẽ, nuôi lắc 200 vòng/phút, 37oC, 12-16 giờ trong tube falcon (chứ a 3 ml LB