Để thiết kế mồi cho gen NA của virus H5N1, chúng tôi đã download 92 trình tự nucleotide gen NA của cá c chủng virus H5N1 (đa ̣i diê ̣n cho các khu vực trên thế giới và Viê ̣t Nam ) đã được công bố trên GenBank từ năm 2003 đến 2010. Các chủng virus A/H5N1 được sử dụng để thiết kế mồi được phân lập ở nhiều đối tượng vật chủ như gà, gà tây, vịt, ngỗng và người...
Các trình tự gen NA này được so sán h bằng phần mềm Clustal X2.0.11, phân tích kết quả so sánh bằng phần mềm BioEdit và FastPCR 5.4. Chúng tôi đã lựa chọn được cặp khuếch đa ̣i trình tự đă ̣c hiê ̣u trên gen NA của H5N1 trong bảng 3.3: Bảng 3.3: Cặp mồi phát hiện gen NA của virus cúm A/H5N1
Tên mồi Trình tự 5’-3’ Vị trí Tm %GC
DiagN1F CCAGTTGGTTGACAATTGGAAT 503-524 54.5 40.9 DiagN1R GCATCAGGATAACAGGAGCA 794-775 55.4 50.0
Các mồi xuôi (DiagN1F) và mồi ngược (DiagN1R) đươ ̣c lựa cho ̣n để khuếch đa ̣i gen NA của H 5N1 có trình tự trùng khớp với hầu hết các chủng H 5N1 đã download, chỉ có một số chủng có sự khác biệt ở 1-2 nucleotide ở đầu 5’ hoă ̣c ở giữa trình tự nên cũng ít ảnh hưởng đến khả năng gắn mồi vào khuôn đích (hình 3.3).
Hình 3.3: Đặc điểm cặp mồi phát hiện gen NA của virus cúm A/N1
Phân tích kết quả so sánh trên FastPCR cho thấy, mồi xuôi (22 nucleotide) và mồi ngược (20 nucleotide) có Tm tương đương nhau khoảng 55oC. Không có sự tạo dimer giữa các mồi. Cặp mồi khuếch đại đoạn DNA có kích thước 292 bp.
Để kiểm tra xem cặp mồi này có đặc hiệu với N 1 hay không , chúng tôi đã thực hiện Primer- Blast với các trình tự DNA của virus cúm A có trên Genbank. Kết
quả cho thấ y cặp mồi này chỉ khuếch đại đoạn gen NA có kích thước 292 bp của virus cúm A/N1.
Như vậy, sau khi phân tích các trình tự gen H 5, N1 và M của virus cúm A đã công bố trên GenBank bằng các phần mềm chuyên du ̣ng , 3 că ̣p mồi đã được thiết kế để thực hiện phản ứng RT-PCR phát hiê ̣n virus cúm A/H5N1 trong bảng (3.4):
Bảng 3.4: Trình tự các mồi được lựa chọn để thực hiện phản ứng RT-PCR
Tên mồi Trình tự 5’-3’ Vị trí Kích thước (bp) Tm (oC) DiagMF GTCTTCTAACCGAGGTCGAAAC 5-26 154 55.1 DiagMR GTGACAGGATTGGTCTTGTCTT 158-139 55.8 DiagH5F AGTGATCAGATTTGCATTGGTTAC 46-69 371 54.6 DiagH5R GACCAAGAACTTTTGGGGATG 416-396 55.4 DiagN1F CCAGTTGGTTGACAATTGGAAT 503-524 292 54.5 DiagN1R GCATCAGGATAACAGGAGCA 794-775 55.4
Phân tích đồng thời cả 3 cặp mồi này trên FastPCR 5.4 cho thấy, các cặp mồi có nhiệt độ biến tính (Tm) tương đương nhau, các mồi không bắt cặp bổ sung nhau tạo primer – dimer nên không giảm khả năng gắn mồi với gen đích khi tất cả các mồi được cho vào cùng một phản ứng. Và mỗi cặp mồi chỉ đặc hiệu với gen tương ứng và kích thước các đoạn khuếch đại phân biệt nhau trên bản gel điện di nên chúng tôi sử dụng 3 cặp mồi này trong phản ứng multiplex RT-PCR để xây dựng quy trình chẩn đoán cúm A/H5N1.
3.2. Tối ƣu phản ứng RT-PCR phát hiện từng gen M, HA và NA 3.2.1 Tối ƣu nhiệt độ gắn mồi 3.2.1 Tối ƣu nhiệt độ gắn mồi
Các phản ứng RT-PCR phát hiện từng gen riêng rẽ được thực hiện ở các nhiệt độ gắn mồi khác nhau từ 53oC đến 60o
C. Sản phẩm phản ứng (10 µl) được điê ̣n di trên gel agarose 2%, nhuô ̣m trong dung dịch ethidium bromide 0,5 µg/ml 15 phút, quan sát và chu ̣p ảnh trên hê ̣ thống chu ̣p ảnh gel để phân tích kết quả. Kết quả điện di (hình 3.4) cho thấy, ở các nhiệt độ gắn mồi khác nhau phản ứng RT-PCR
với từng cặp mồi đều cho kết quả khác nhau. Nhiệt độ gắn mồi của cặp mồi phát hiện gen M (hình 3.4A) cho băng sản phẩm PCR 154 bp tương đối rõ ở dải nhiệt độ thử nghiệm, tuy nhiên ở 55oC cho tín hiệu band sáng và rõ nét nhất. Trên hình 3.4B cho thấy tín hiệu băng sản phẩm PCR 371 bp phát hiện gen HA mờ và không rõ nét ở nhiệt độ gắn mồi ở 60oC và dưới 55oC; band sáng, rõ nét nhất ở 57oC. Còn trên bản điện di (hình 3.4C) băng phát hiện gen NA có kích thước 292 bp cho tín hiệu sáng và rõ nét nhất ở 57o
C. Từ kết quả của các phản ứng RT-PCR phát hiện từng gen riêng biệt được thử nghiệm ở các nhiệt độ gắn mồi khác nhau, sản phẩm phản ứng đạt hiệu quả tốt nhất ở nhiệt độ gắn mồi 55oC cho cặp mồi phát hiện gen M và 57oC cho cặp mồi phát gen HA và NA.
Hình 3.4. Ảnh điện di kết quả tối ưu nhiệt độ gắn mồi cho phản ứng RT-PCR phát hiện từng gen riêng biệt: (A)- gen M, (B)- gen HA, (C)- gen NA
M: Thang DNA chuẩn 100 bp. Nhiệt độ gắn mồi (oC) được ghi chú phía trên
3.2.2. Tối ƣu nồng độ mồi
Phản ứng RT-PCR cho từng cặp mồi được thử nghiệm ở các nồng độ mồi khác nhau 0.3 µM, 0.4 µM, 0.5 µM, 0.6 µM, 0.7 µM, 0.8 µM và 0.9 µM. Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR trên gel agarose 2% (hình 3.5) cho thấy: ở các nồng độ mồi khác nhau, các phản ứng RT- PCR cho các kết quả khác nhau.
Hình 3.5A: Phản ứng RT-PCR phát hiện gen M ở nồng độ mồi 0.3 µM và 0.4 µM, cho tín hiệu band 154 bp mờ và chưa rõ nét. Ở nồng độ 0.6 µM và 0.7 µM các band sản phẩm RT-PCR rõ nét nhưng xuất hiện băng phụ dimer rõ ở phía dưới. Ở nồng độ mồi 0.5 µM phản ứng cho band sáng rõ nét nhất và band phụ dimer mờ.
Hình 3.5B: Phản ứng RT-PCR phát hiện gen HA, band sản phẩm phản ứng có kích thước 371 bp có tín hiệu đẹp nhất ở 0.4 µM. Ở nồng độ 0.5 µM band cũng sáng và rõ nhưng band phụ dimer xuất hiện ở dưới nhiều hơn so với ở nồng độ 0.4 µM. Còn ở các nồng độ mồi khác sản phẩm RT-PCR thấp (các band mờ hơn).
Hình 3.5C: Phản ứng RT-PCR phát hiện gen NA ở nồng độ mồi 0.5 µM cho band 292 pb sáng, rõ nét và ít dimer nhất so với các band ở các nồng độ mồi khác.
Hình 3.5. Ảnh kết quả điện di tối ưu nồng độ mồi cho phản ứng RT-PCR M: Thang DNA chuẩn 100 bp; Nồng độ mồi (µM) được ghi chú ở trên
Như vậy, từ phân tích kết quả thử nghiệm nồng độ mồi độ mồi khác nhau, chúng tôi lựa chọn nồng độ mồi tối ưu cho phản ứng RT-PCR phát hiện gen M và gen NA là 0.5 µM, phát hiện gen HA là 0.4 µM.
3.2.3. Tối ƣu thời gian kéo dài chuỗi
Chúng tôi đã tiến hành thử nghiệm phản ứng RT-PCR phát hiện từng gen M, HA va NA ở thời gian kéo dài chuỗi là 30 giây, 45 giây và 60 giây. Sản phẩm phản
phản ứng RT-PCR đều cho các band (154 bp-M; 292 pb-NA; 371 bp-HA) sáng và rõ nét ở các thời gian kéo dài 30 giây và 45 giây và 60 giây. Như vậy, sản phẩm khuếch đại không có sự khác biệt nhiều khi thay đổi thời gian kéo dài chuỗi từ 30 giây đến 60 giây. Để rút ngắn thời gian xét nghiệm mà sản phẩm khuếch đại vẫn đạt kết quả tốt chúng tôi lựa chọn thời gian kéo dài chuỗi thích hợp nhất là 30 giây cho cả 3 phản ứng RT-PCR phát hiện gen M, HA và NA.
Hình 3.6. Ảnh điện di kết quả tối ưu thời gian kéo dài chuỗi
M: Thang DNA chuẩn 100 pb; Thời gian kéo dài chuỗi (giây-s) được ghi ở trên
Về số chu kỳ phản ứng cho mỗi phản ứng RT-PCR phát hiện từng gen riêng biệt, chúng tôi cũng đã tiến hành tối ưu và kết quả cho thấy số chu kỳ thích hợp nhất là 40 chu kỳ.
3.2.4. Đánh giá độ nhạy của phản ứng RT-PCR
Sau khi tạo được plasmid tái tổ hợp của 3 gen M, HA và NA, chúng tôi thực hiện phiên mã ngược để thu RNA. Kết quả đo OD dung dịch RNA của 3 gen M, HA và NA ở 260 nm và 280 nm trong bảng 3.5:
Bảng 3.5: Giá trị đo độ hấp thụ OD của RNA 3 gen M, HA và NA
Số thứ tự Gen OD260(nm) OD280(nm) OD260/OD280 Nồng độ (µg/µl)
1 M 0.027 0.014 1.93 1.08
2 HA 0.023 0.012 1.91 0.92
Tỷ lệ OD260/OD280 dung dịch RNA các gen M, HA và NA nằm trong khoảng 1.8-2.0, cho thấy RNA thu được là tinh khiết. Dựa vào giá trị OD260 tính số bản sao RNA trong 1 µl của mỗi gen M, HA và NA lần lượt là 22x1011, 10x1011, 15x1011 Từ nồng độ ban đầu chúng tôi pha loãng thành các nồng độ giảm dần từ 1011, 1010, 109, 108,.... 101 bản sao/µl để làm mẫu chuẩn đánh giá độ nhạy của phản ứng.
Để đánh giá độ nhạy, phản ứng RT-PCR được thực hiện với mẫu RNA chuẩn của virus cúm A/H5N1 có nồng độ khác nhau từ 101 đến 109 bản sao RNA/µl và sử dụng 10 µl để điê ̣n di trên gel a garose 2%. Kết quả điê ̣n di (hình 3.7) cho thấy cả 3 phản ứng phát hiện 3 gen M, HA và NA đều dương tính (quan sát đươ ̣c các vạch DNA sau khi nhuô ̣m e thidium bromide ) khi trong mẫu có từ 10 bản sao RNA trở lên.
Hình 3.7. Ảnh điện di đánh giá độ nhạy của phản ứng RT-PCR
M: Thang DNA chuẩn 100 bp; NC: Chứng âm; Số lượng bản sao RNA được ghi chú ở trên
3.2.5. Đánh giá độ đặc hiệu của phản ứng RT-PCR
Phản ứng RT-PCR với từng cặp mồi đã tối ưu được thực hiện với các mẫu RNA của một số virus cúm B, cúm A/H1N1; cúm A/H5 và cúm A/H3 không phải subtype N1; vật liệu di truyền của một số loài vi khuẩn, người, virus viêm gan C để kiểm tra độ đặc hiệu của phản ứng. Sản phẩm phản ứng được điện di kiểm tra bằng gel agarose 2% đều cho kết quả chỉ đặc hiệu với các gen M của virus cúm A, gen HA của subtype A/H5 và gen NA của subtybe A/N1.
Như vậy, chúng tôi đã chọn được điều kiện tối ưu cho phản ứng RT- PCR đối với từng cặp mồi đã thiết kế để phát hiện từng gen M, HA và NA của virus cúm A/H5N1 như sau:
- Phản ứng RT-PCR phát hiện gen M:
Thành phần phản ứng (bảng 3.6):
Bảng 3.6: Thành phần phản ứng RT-PCR phát hiện gen M:
Thứ tự Sinh phẩm Thể tích (l) Nồng độ cuối
1 RNase free water 25.75
2 Qiagen Onestep RT-PCR buffer 5X
10 1X
3 dNTP mix 10 mM each 2 0.4 mM each
4 DiagMF 10 M 2.5 0.5 M 5 DiagMR 10 M 2.5 0.5 M 6 Qiagen Onestep RT-PCR Enzyme mix 2 7 RNase Inhibitor 40 U/l 0.25 10 U 8 RNA template 5 1 pg – 2 g Tổng thể tích phản ứng 50
Chu trình nhiệt (bảng 3.7):
Bảng 3.7: Chu trình nhiệt của phản ứng RT-PCR phát hiện gen M
Thứ tự Nhiê ̣t độ (o
C) Thời gian Số chu kỳ
1 50 30 phút 1 2 95 15 phút 1 3 94 30 giây 40 4 55 30 giây 5 72 30 giây 6 72 5 phút 1
- Phản ứng RT-PCR phát hiện gen HA:
Thành phần phản ứng (bảng 3.8):
Bảng 3.8: Thành phần phản ứng RT-PCR phát hiện gen H5
Thứ tự Sinh phẩm Thể tích (l) Nồng độ cuối
1 RNase free water 26.75
2 Qiagen Onestep RT-PCR buffer 5X
10 1X
3 dNTP mix 10 mM each 2 0.4 mM each
4 Diag H5F 10 M 2 0.4 M 5 Diag H5R 10 M 2 0.4 M 6 Qiagen Onestep RT-PCR Enzyme mix 2 7 RNase Inhibitor 40 U/l 0.25 10 U 8 RNA template 5 1 pg – 2 g Tổng thể tích phản ứng 50 Chu trình nhiệt (Bảng 3.9):
Bảng 3.9: Chu trình nhiệt phản ứng RT-PCR phát hiện gen H5:
Thứ tự Nhiê ̣t độ (oC) Thời gian Số chu kỳ
2 95 15 phút 1 3 94 30 giây 40 4 57 30 giây 5 72 30 giây 6 72 5 phút 1
- Phản ứng RT-PCR phát hiện gen NA:
Thành phần phản ứng (bảng 3.10):
Bảng 3.10: Thành phần phản ứng RT-PCR phát hiện gen N1
Thứ tự Sinh phẩm Thể tích (l) Nồng độ cuối
1 RNase free water 25.75
2 Qiagen Onestep RT-PCR buffer 5X
10 1X
3 dNTP mix 10 mM each 2 0.4 mM each
4 Diag N1F 10 M 2.5 0.5 M 5 Diag N1R 10 M 2.5 0.5 M 6 Qiagen Onestep RT-PCR Enzyme mix 2 7 RNase Inhibitor 40 U/l 0.25 10 U 8 RNA template 5 1 pg – 2 g Tổng thể tích phản ứng 50 Chu trình nhiệt (bảng 3.11):
Bảng 3.11: Chu trình nhiệt phản ứng RT-PCR phát hiện gen N1
Thứ tự Nhiê ̣t độ (oC) Thời gian Số chu kỳ
1 50 30 phút 1 2 95 15 phút 1 3 94 30 giây 40 4 57 30 giây 5 72 30 giây 6 72 5 phút 1
3.3. Tối ƣu phản ứng multiplex RT-PCR phát hiện virus A/H5N1
Phản ứng multiplex RT-PCR là một dạng thay đổi của phản ứng RT-PCR, ở đó hai hay hoặc nhiều hơn hai đoạn gen đích được khuếch đại lên đồng thời trong cùng một phản ứng. Việc kết hợp nhiều mồi trong một phản ứng và để nhân lên đồng thời nhiều đoạn gen đích đòi hỏi sự thay đổi/tối ưu các thông số của phản ứng.
3.3.1. Tối ƣu nhiệt độ gắn mồi
Việc thay đổi thời gian gắn mồi từ 30 - 60 phút không làm thay đổi nhiều về hiệu quả khuếch đại (không minh hoạ), nhưng nhiệt độ gắn mồi là một trong các thông số quan trọng nhất. Sản phẩm multiplex RT-PCR ở dải nhiệt độ gắn mồi từ 54oC đến 59oC được điện di trên gel agarose 2% (hình 3.8) cho thấy cả 3 đoạn DNA đích đặc hiệu của 3 gen M (154 pb), HA (371 bp) và NA (292 bp) đều được khuếch đại lên đồng thời trong hỗn hợp phản ứng multiplex RT-PCR. Tuy nhiên, ở 57oC cả 3 band đều sáng và rõ nét nhất. Còn ở các nhiệt độ khác 2 band gen M và NA đều sáng và rõ nét nhưng band gen HA lại mờ. Như vậy, ở 57oC là nhiệt độ gắn mồi thích hợp nhất cho cả 3 cặp mồi trong phản ứng multiplex RT-PCR.
Hình 3.8: Ảnh điện di tối ưu nhiệt độ gắn mồi cho phản ứng multiplex RT-PCR.
M: thang DNA chuẩn 100 bp. Nhiệt độ gắn mồi (oC) được ghi chú phía trên.
3.3.2. Tối ƣu nồng độ mồi
Để chọn được nồng độ các cặp mồi thích hợp nhất trong cùng phản ứng multiplex RT-PCR, ban đầu chúng tôi thực hiện phản ứng với nồng độ các mồi đã tối ưu ở phản ứng RT-PCR phát hiện từng gen riêng biệt là 0.5 M (M), 0.4 M
(HA) và 0.5 M (NA). Kết quả, điện di sản phẩm phản ứng trên gel agarose 2% (hình 3.9A) cho thấy ở nồng độ các mồi này sản phẩm khuếch đại gen M rất cao (band 154 bp sáng và rõ nét) còn sản phẩm khuếch đại gen HA và NA lại rất thấp (band 292 pb và 371 bp mờ và không rõ nét). Nồng độ mồi phát hiện gen NA và HA không còn đặc hiệu trong phản ứng multiplex RT-PCR là do cặp mồi DiagM đặc hiệu hơn và đoạn gen đích của nó ngắn hơn nên khả năng gắn mồi cũng như khả năng ưu tiên hoạt động cho Taq polymerase tốt hơn so với cặp mồi DaigH5 và DiagN1. Căn cứ vào kết quả này, chúng tôi hạ nồng độ gen M, tăng nồng độ gen HA và NA và kết quả điện di (hình 3.9B) cho thấy ở nồng độ gen M, HA và NA lần lượt là 0.3 M, 0.5 M và 0.4 M cho tín hiệu cả 3 band đều sáng và rõ nét nhất.
Hình 3.9. Ảnh điện di tối ưu nồng độ mồi phản ứng multiplex RT-PCR NC: Chứng âm; M: thang DNA chuẩn 100bp;
A: 1: (0.5 M –M, 0.4 M – HA và 0.5 M – NA) B: 2: (0.3 M –M, 0.4 M – HA và 0.5 M – NA)
3: (0.3 M –M, 0.5 M – HA và 0.4 M – NA) 4:(0.5 M –M, 0.5 M – HA và 0.5 M – NA) 5:(0.5 M –M, 0.7 M – HA và 0.6 M – NA)
3.3.3. Tối ƣu thời gian kéo dài chuỗi
Trong phản ứng multiplex RT-PCR, khi nhiều đoạn DNA được nhân lên đồng thời, phần đóng góp của enzyme và các nucleotide trở thành một nhân tố giới hạn và có thể cần phải có nhiều thời gian cho sự trùng hợp các phân tử để hoàn
thành quá trình tổng hợp của tất cả các sản phẩm. Kết quả điện di sản phẩm phản ứng ở các thời gian kéo dài chuỗi 30 giây, 45 giây và 60 giây (hình 3.10) cho thấy không có sự khác biệt nhiều về lượng sản phẩm khuếch đại ở các phản ứng. Để góp phần rút ngắn thời gian làm xét nghiệm, chúng tôi lựa chọn thời gian kéo dài chuỗi