Thiết kế mồi

Mồi là những đoạn oligonucleotide dài khoảng 18-30 nucleotide có trình tự bổ sung với hai đầu của đoạn DNA muốn khuếch đại. Mồi có vai trò khởi động enzyme DNA polyemerase để kéo dài chuỗi DNA đích và quyết định hiệu quả và độ chính xác của phản ứng PCR.

mồi. Các mồi thiết kế phải đặc hiệu với các gen đặc trưng cho đối tượng cần xác định. Để chẩn đoán virus cúm A/H5N1, chúng tôi tiến hành thiết kế 3 cặp mồi phát hiê ̣n 3 trình tự đặc hiệu trên 3 gen M, HA và NA bao gồm:

- Cặp mồi khuếch đa ̣i trình tự nucleotide đă ̣c hiê ̣u trên g en M của tất cả các subtype của virus cúm A.

- Cặp mồi khuếch đa ̣i trình tự nucleotide đă ̣c hiê ̣u trên gen HA của virus cúm A subtype H5 và không khuếch đại trình tự nucleotide tương đương với các subtype HA khác.

- Cặp mồi khuếch đa ̣i trình tự nucleotide đă ̣c hiê ̣u trên gen NA của virus cúm A subtype N1 và không khuếch đại trình tự nucleotide tương đương vớ i các subtype NA khác

Các cặp mồi được thiết kế dựa trên trình tự gen M, HA và NA của các chủng virus cúm A/H5N1 đã công bố trên Genbank theo các nguyên tắc nhất định về: kích thước mồi từ 18-30 nucleotide; nhiệt độ biến tính các mồi (Tm) tương đương nhau; tỷ lệ GC trong mồi từ 40-60%; trình tự nucleotide của mồi đặc hiệu với khuôn; tránh bắt cặp bổ sung của 2 hoặc nhiều hơn các nucleotide tại đầu 3’ của các mồi để giảm sự hình thành primer-dimer; các nucleotide ở đầu 3’ của mồi bắt cặp hoàn toàn đặc hiệu với trình tự đích để giảm thiểu tối đa hiện tượng bắt cặp sai; tránh 3 hoặc nhiều hơn G hoặc C tại đầu 3’ liền nhau; tránh trình tự bắt cặp bổ sung bên trong mỗi mồi và giữa các mồi; chọn vị trí mồi sao cho kích thước các đoạn DNA đích nhân lên trong phản ứng multiplex RT-PCR phân biệt được trên bản điện di. Để thiết kế mồi, chúng tôi sử dụng các phần mềm chuyên dùng cho thiết kế mồi đó là FastPCR5.4, BioEdit, Clustalx2.0.11. Các bước thiết kế các cặp mồi đặc hiệu các gen M, HA và NA như sau:

+ Mở trang web của NCBI (National Center for Biotechnology Information)

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/Database/request.cgi), lựa cho ̣n các thông tin cần thiết về: loài virus (virus cúm A), vâ ̣t chủ (bất kỳ), khu vực (bất kỳ), các gen cần download (M, HA và NA), thờ i gian lưu hành, subtype (H5N1),...

+ Download các trình tự nucleotide của các gen M, HA và NA của virus đã đươ ̣c công bố trên GenB ank dưới da ̣ng FASTA file . Các chủng virus chọn để thiết kế mồi được phân lập từ nhiều đối tượng khác nhau.

+ Tiến hành so sánh các trình tự nucleotide bằng phần mềm Clustal X 2.0.11 + Phân tích kết quả so sánh bằng phần mềm BioEdit , lựa chọn các đoạn trình tự có đô ̣ lă ̣p la ̣i cao để thiết kế mồi cho các gen.

+ Phân tích các trình tự có đô ̣ lă ̣p la ̣i cao bằng phần mềm FastPCR 5.4 để lựa chọn các trình tự m ồi đặc hiê ̣u sử du ̣ng được trong cùng một phản ứng multiplex RT-PCR chẩn đoán cúm A/H5N1.

+ Kiểm tra độ đặc hiệu của các cặp mồi đã chọn bằng Primer - Blast với các trình tự DNA của virus cúm có trên ngân hàng dữ liệu gene của NCBI.

Cặp mồi thiết kế phát hiện gen M được lựa chọn từ những vùng bảo tồn trên gen M của các subtype virus cúm A khác nhau. Trong khi đó, các mồi phát hiện gen H5 và N1 được lựa chọn từ những vùng không thay đổi (ít bị đột biến) trên các trình tự gen HA và NA của virus cúm A subtype H5N1.

2.2.5. Tối ƣu phản ứng RT-PCR phát hiện từng gen M, HA và NA

Sau khi thiết kế được các cặp mồi, chúng tôi thực hiện phản ứng RT-PCR vớ i từng că ̣p mồi riêng rẽ để xác định các điều kiện (nồng đô ̣ mồi, nhiê ̣t đô ̣ và thời gian gắn mồi, thời gian kéo dài chuỗi, số chu kỳ lă ̣p la ̣i) thích hợp nhất để phát hiện được từng gen M, HA và NA của virus cúm A/H5N1. Phản ứng RT-PCR được thực hiện với bô ̣ sinh phẩm Qiagen Onestep RT-PCR, trên máy luân nhiê ̣t C 1000 (Biorad). Theo bộ sinh phẩm này, cả hai giai đoạn phiên mã ngược tạo cDNA (phản ứng RT) và giai đoạn khuếch đại (phản ứng PCR) được thực hiện trong cùng một tube phản ứng, nghĩa là sau khi cho RNA tách chiết vào tube, phản ứng phiên mã ngược sẽ được thực hiện trước nhờ enzyme Omniscript and Sensiscrip Reverse Transcriptases và tiếp đến phản ứng PCR nhờ enzyme Hot Star Taq DNA polymerase. Như vậy, tất cả các thành phần của phản ứng RT và PCR được cho vào một tube phản ứng trong cùng một lần. Thể tích của mỗi phản ứng RT-PCR thử nghiệm là 50 l bao gồm các thành phần trong bảng 2.1:

Bảng 2.1: Các thành phần của phản ứng RT-PCR

Thứ tự Sinh phẩm Thể tích (l) Nồng độ cuối

1 RNase free water 2 Qiagen Onestep RT-PCR

buffer 5X

10 1X

3 dNTP mix 10 mM each 2 0.4 mM each

4 Primer forward 10 M 5 Primer reverse 10 M 6 Qiagen Onestep RT-PCR Enzyme mix 2 7 RNase Inhibitor 40 U/l 5 – 10 U

8 RNA của A/H5N1 1 pg - 2 g

Tổng cô ̣ng 50

Chu trình nhiệt của phản ứng (bảng 2.2):

Bảng 2.2: Chu trình nhiệt của phản ứng RT-PCR

Thứ tự Các bước Thời gian

(phút)

Nhiệt độ (oC)

1 Phiên mã ngược (RT) 30 50

2 Hoạt hoá Hot Star Taq DNA polymerase, ức chế enzyme phiên mã ngược, biến tính

cDNA ban đầu

15 95 3 Biến tính cDNA 0.5 94 4 Gắn mồi 0.5-1 51-60 5 Kéo dài 0.5-1 72 6 Số chu kỳ 35-50 7 Hoàn thiện 5 72

Sản phẩm DNA khuếch đại được phát hiện bằng điện di trên gel agarose 2%, nhuộm dung dịch ethidium bromide 0.5 µg/ml 15 phút. Gel được chụp ảnh và phân tích kết quả. Kích thước các vạch DNA được so sánh với thang DNA chuẩn 100 bp.

Tối ưu nhiệt độ gắn mồi:

Muốn mồi có thể bắt cặp hoàn toàn đặc hiệu trên sợi khuôn thì phải xác định được nhiệt độ gắn mồi (Ta- annealing temperature) tối ưu cho từng cặp mồi. Nhiệt độ bắt cặp mồi tối ưu có thể nhỏ hơn hoặc lớn hơn nhiệt độ biến tính mồi (Tm - melting temperature). Bắt đầu tối ưu nhiệt độ gắn mồi ở nhiệt độ nhỏ hơn Tm mồi khoảng 4-5oC. Chúng tôi lựa chọn dải nhiệt độ 51oC đến 60oC để thử nghiệm tìm ra nhiệt độ gắn mồi tối ưu cho mỗi cặp mồi.

Tối ưu nồng độ mồi:

Mồi là một chỉ tiêu quan trọng của phản ứng PCR để quyết định tính đặc trưng và hiệu quả của phản ứng. Nồng độ mồi thấp sẽ ảnh hưởng đến hiệu quả bắt cặp, sẩn phẩm khuếch đại thấp. Ngược lại, nồng độ mồi quá cao sẽ hình thành những bắt cặp không đặc hiệu trên các vị trí khác nhau của mẫu và xuất hiện các primer - dimer, làm giảm sản phẩm PCR của các đoạn cần khuếch đại. Để tìm được nồng độ mồi tối ưu cho mỗi phản ứng RT-PCR với từng cặp mồi đã thiết kế, chúng tôi thử nghiệm ở các nồng độ 0.3 µM, 0.4 µM, 0.5 µM; 0.6 µM; 0.7 µM; 0.8 µM và 0.9 µM.

Tối ưu thời gian gắn mồi và kéo dài chuỗi:

Thời gian kéo dài chuỗi phụ thuộc vào enzyme DNA polymerase, chiều dài sản phẩm và loại template. Thời gian kéo dài thử nghiệm ở 30 giây, 45 giây và 60 giây để xác định thời gian kéo dài chuỗi thích hợp nhất ở mỗi chu trình nhiệt của từng phản ứng.

Thời gian gắn mồi cũng được lựa chọn kiểm tra ở 30 giây, 45 giây và 60 giây.

Tối ưu số chu kỳ phản ứng RT-PCR:

Để phân tích được bằng điện di, thì sản phẩm PCR phải đạt lượng nhất định. Số chu kỳ của phản ứng quá thấp sẽ không đủ để tạo ra tín hiệu có thể phát hiện, còn số chu kỳ quá cao có thể làm xuất hiện các sản phẩm không đặc hiệu và tốn nhiều thời gian đối với các xét nghiệm cần chẩn đoán nhanh. Trung bình số chu kỳ phản ứng khoảng 25-30 chu kỳ, nhưng trong phản ứng RT-PCR số chu kỳ phụ

thuộc vào nồng độ mẫu RNA cao hay thấp và lượng sản phẩm cDNA của phản ứng phiên mã ngược. Để có số chu kỳ thích hợp cho mỗi phản ứng RT-PCR phát hiện từng riêng rẽ, chúng tôi kiểm tra số lượng chu kỳ là 35, 40, 45 và 50 chu kỳ.

Đánh giá độ nhạy của phản ứng RT-PCR phát hiện từng gen M, HA và NA:

Độ nhạy của phản ứng RT-PCR là số bản copy RNA nhỏ nhất mà phản ứng PCR cho kết quả dương tính. Để đánh giá độ nhạy của mỗi phản ứng RT-PCR, chúng tối sử dụng các gen HA , NA và M của chủng virus cúm A /H5N1 gắn vào plasmid pJET 1.2/blunt (Fermentas) tạo plasmid tái tổ hợp theo bộ sinh phẩm CloneJET™ PCR Cloning Kit. Các bước như sau:

- Gắn các gen M, HA, NA vào vector pJET1.2/blunt (2974 bp): Làm tan đông sản phẩm PCR , các sinh phẩm trong bộ kit C loneJet PCR Cloning và đă ̣t trên đá bào. Hút 6 l (Nuclease free water), 10 l (2X reaction buffer), 1 l (sản phẩm PCR), 1 l (DNA blunting enzyme) vào tube PCR 0.2 ml, vortex và ly tâm nhẹ trong 3-5 giây. Sau đó ủ ở 70oC trong 5 phút r ồi đặt ngay lê n đá la ̣nh . Tiếp theo, thêm vào mỗi tube PCR 1 l (pJET 1.2/blunt cloning vector – 50 ng/l) và 1 l (T4 DNA ligase - 5 u/l), vortex và ly tâm nhẹ trong 3-5 giây rồi để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Sản phẩm phản ứng được sử dụng trực tiếp để biến nạp vào vi khuẩn E.coli.

- Tạo tế bào khả biến: Sau khi gắn trình tự gen của virus cúm A /H5N1 vào plasmid pJET 1.2, để nhân lượng plasmid thì cần phải biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào E.coli TOP10 và nuôi cấy tế bào để plasmid có thể nhân lên với số lượng lớn. Để tế bào E .coli có thể dung na ̣p plasmid , chúng tôi tạo tế bào E.coli khả biến bằng phương pháp CaCl2 để làm cho vi khuẩn E .coli trở nên khả biến . Các bước: Nuôi tế bào E .coli trong 2 ml LB lỏng, lắc 200 vòng/phút ở 37oC qua đêm. Sau đó cấy chuyển 40 l di ̣ch cấy tế bào sang tube chứa 2 ml LB, lắc 200 vòng/phút ở 37oC trong 2 giờ rồi để trên đá 10 phút, ly tâm 4000 vòng/phút trong 5 phút ở 4oC. Hút bỏ dịch nổi, thu lấy cặn. Bổ sung 1 ml CaCl2 100 mM (để ở 4oC từ trước). Tiếp theo ly tâm 4000 vòng/phút trong 5 phút ở 4o

C, hút bỏ dịch nổi, thu lấy cặn . Bổ sung một

và 30 l glycerol. Trộn đều, chia vào các tube , mỗi tube 50 l. Giữ trên đá 1-2 giờ trước khi biến na ̣p (hoă ̣c đông la ̣nh bằng nitơ lỏng và bảo quản ở -85oC).

- Biến nạp DNA plasmid vào tế bào khả biến: Lấy tế bào khả biến từ -85oC, để trên đá 30 phút (hoă ̣c sử du ̣ng tế bào khả biế n vừa chuẩn bi ̣). Bổ sung 5 l hỗn hơ ̣p lai vào 50 l tế bào khả biến, để trên đá 30 phút. Sốc nhiê ̣t ở 42oC trong 2 phút, sau đó đă ̣t ngay lên đá b ào trong 2 phút. Bổ sung 200 l LB lỏng, lắc 200 vòng/phút ở

37oC trong 1 giờ . Trải dịch nuôi trên môi trường thạch LB có bổ sung Ampicillin (100 g/ml), nuôi ở 37oC qua đêm.

- Tách chiết plasmid với GeneJET Plasmid Miniprep Kit : Lấy 1 khuẩn lạc riêng rẽ, nuôi lắc 200 vòng/phút, 37oC, 12-16 giờ trong tube falcon (chứ a 3 ml LB lỏng đã bổ sung Ampicillin ). Ly tâm 8000 vòng/phút trong 2 phút, loại bỏ dịch nổi , thu lấy că ̣n, sử du ̣ng că ̣n này để tách chiết plasmid tái tổ hợp. Các bước: hòa tan cặn tế bào trong 250 l Resuspension Solution, bổ sung 250 l Lysis Solution và trộn đều. Thêm 350 l Neutralization Solution , trộn đều. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút để làm lắng các thành phần của tế bào và DNA nhiễ m sắc thể . Chuyển dịch nổi chứa plasmid sang GeneJET spin column. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, đổ bỏ di ̣ch và đă ̣t column trở la ̣i . Thêm 500 l Wash Solution vào column , ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, đổ bỏ di ̣ch và đă ̣t column trở la ̣i (làm 2 lần). Ly tâm 13000 vòng/phút, 1 phút để loại bỏ hoàn toàn dung dịch trong colum n. Chuyển column sang mô ̣t tube 1.5 ml, bổ sung 50 l Elution Buffer vào chính giữa màng lọc của cột . Ly tâm 13000 vòng/phút trong 2 phút và vứt bỏ cô ̣t lo ̣c . Điê ̣n di 5 l trên gel agarose 1% để kiểm tra sự tinh sạch của plasmid . Bảo quản plasmid tinh sạch ở -20o

C. Để chắc chắn trình tự gen của virus cúm A /H5N1 đã đươ ̣c gắn với plasmid chúng tôi kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng phản ứng PCR.

- Sau khi có plasdmid gắn các gen M, HA và NA của virus A/H5N1 tiến hành tổng hơ ̣p RNA với bô ̣ sinh phẩm TranscriptAid™ T 7 High Yield Transcription Kit (Fermentas). Các bước:

+ Chuẩn bị 20µl thể tích phản ứng RT ở nhiệt độ phòng gồm các thành phần: 4 µl (5X TranscriptAid Reaction Buffer); 8 µl (ATP/CTP/GTP/UTP mix); 1 µg

+ Trộn đều, ly tâm nhẹ và ủ ở nhiệt độ 37oC trong 2 giờ.

Tinh sạch RNA được phiên mã: Các plasmid tái tổ hợp (DNA) sau phiên mã được loại bỏ nhờ DNase I. RNA phiên mã được tách chiết với phenol:chloroform, kết tủa RNA bằng ethanol:

+ Bổ sung 115 µl DEPC-treated water và 15 µl dung dịch Sodium Acetate 3 M, pH 5.2 vào 20 µl hỗn hợp phản ứng phiên mã. Trộn đều.

+ Bổ sung hỗn hợp phenol/chloroform với tỷ lệ 1:1, sau đó xử lý 2 lần với chloroform tho tỷ lệ 1:1. Ly tâm và hút dịch ở pha trên sang một tube mới.

+ Tủa RNA bằng với 2 thể tích ethanol. Ủ ở -20oC ít nhất 30 phút và ly tâm để thu RNA.

+ Loại bỏ dịch nổi, thêm 500 µl ethanol 70% lạnh để rửa tủa.

+ Hoà tủa RNA với 20 µl DEPC-treated water, bảo quản RNA ở -20oC hoặc -70oC.

Xác định chất lượng (độ tinh khiết) RNA bằng cách đo khả năng hấp thụ ánh sáng tử ngoại (mật độ quang - OD: Optical density) ở bước sóng 260nm và 280nm trên máy Biophotometer (Eppendorf). Nếu tỷ lệ OD260/OD280 nằm trong khoảng 1.8 - 2.0 thì RNA là tinh khiết. Từ giá trị OD260nm, xác định nồng độ của RNA theo công thức:

Nồng độ dung dịch RNA (ng/µl) = OD260 x 40 ng/µl

Dựa vào nồng đô ̣ RNA và kích thước của đoạn RNA được phiên mã tính được số bản sao RNA trong mô ̣t đơn vi ̣ thể tích theo công thức:

Số bản copy/l = [Nồng độ RNA (ng/µl) x 6.023x1023]/[L x 330 x 109 (ng)] Với: L: số nucleotide của RNA; 330x109: Khối lượng 1 nucleotide tính ra ng; 6.023x1023: Số Avogadro.

Sau đó, mẫu RNA được pha loãng thành các dung dịch có nồng độ giảm dần 10 lần đến 101 bản sao RNA/µl và sử du ̣ng làm mẫu chuẩn để đánh giá đô ̣ nha ̣y của phản ứng.

Đánh giá độ đặc hiệu của phản ứng:

Để đánh giá độ đặc hiệu của phản ứng RT-PCR phát hiện gen M, HA và NA chúng tôi sử dụng các mẫu RNA của virus cúm A /H1N1, cúm A/H3, cúm B (Viê ̣n

Vê ̣ sinh Di ̣ch tễ Trung ương cung cấp ), cúm A /H5 (Trung tâm Chẩn đoán Thú Y Trung ương cung cấp) và các mẫu DNA và RNA có sẵn trong phòng thí nghiệm để kiểm tra xem có hiê ̣n tượng phản ứng chéo xảy ra hay không .

2.2.6. Tối ƣu phản ứng Multiplex RT-PCR phát hiện virus A/H5N1

Sau khi xác định được các điều kiện thích hợp nhất cho phản ứng RT-PCR phát hiện từng gen riêng rẽ, chúng tôi tiến hành tối ưu phản ứng multiplex RT- PCR với bộ sinh phẩm Qiagen Onestep RT-PCR để phát hiện đồng thời cả 3 gen của virus A/H5N1 trong cùng một phản ứng. Để tối ưu hoá phản ứng, chúng tôi cũng thử nghiệm ở các điều kiện khác nhau về thành phần, chu trình nhiệt của phản ứng dựa trên các điều kiện đã tối ưu của phản ứng RT-PCR với từng cặp mồi. Phản ứng