MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VIRUS CÚM A/H5N1 Ở VIỆT NAM VÀ TRÊN

THẾ GIỚI

Trước tình hình lây lan của dịch cúm gia cầm, thế giới và Việt Nam đã có nhiều công trình nghiên cứu về phương pháp chẩn đoán, điều trị và dự phòng bệnh cúm. Ngay khi di ̣ch cúm A /H5N1 xảy ra trên gia cầm vào cuối năm 2003, các phòng thí nghiệm trọng điểm của nước ta đã n hanh chóng hoàn thiê ̣n kỹ thuâ ̣t phát hiê ̣n virus cúm A/H5N1 trên mẫu bê ̣nh phẩm bằng kỹ thuâ ̣t RT -PCR đồng thời triển khai kỹ thuâ ̣t giải trình các gen của cúm A/H5N1 nhằm tìm hiểu sâu hơn về chủng virus đang lưu hành ta ̣i Viê ̣t Nam . Những chuỗi gen giúp xác định subtype H5, subtype N1 và các gen cấu trúc đã được Viện Công nghệ Sinh học, Viện Pasteur TP Hồ Chí Minh, Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương, Viện Thú y giải mã và công bố trên Ngân hàng gen [30, 38]. Trên cơ sở phân tích trình tự gen kháng nguyên H5 và N1, các tác giả khẳng định nguồn gốc của virus cúm A gây bệnh trên gia cầm và người tại Việt Nam cùng nhóm với virus H5N1 phân lập tại Trung Quốc [30]. Các biến chủng H5N1 của Hồng Kông, Trung Quốc phân lập những năm 1997 - 2001 và Hàn Quốc, Đài Loan (phân lập năm 2003) đều có nguồn gốc từ chim cút và ngỗng (A/Goose/Guandong/1/96) vùng Quảng Đông (Trung Quốc), đó là các biến chủng thuộc dòng Quảng Đông [30]. Như vậy, virus cúm gia cầm gây bệnh ở gia cầm và

người tại Việt Nam là cúm H5N1 type A thuộc thế hệ mới đã có biến đổi cơ bản về gen H5 và gen N1, nhưng vẫn có cùng nguồn gốc với H5N1 từ vùng địa lý Nam Trung Quốc và Hồng Kông. Các chủng phân lập những năm 2004-2006 đã được nghiên cứu khá chi tiết về góc độ gen học và quan hệ phân tử với các chủng trong vùng và thế giới, kết quả khẳng định virus H5N1 vùng Nam và Đông Nam Á thuộc nhóm di truyền VTM (viết tắt: Vietnam-Thailand-Malaysia), có những đặc tính sinh học nhất định khác với các nhóm vùng Trung Quốc và Hồng Kông [15]. Năm 2007, xuất hiện thêm biến chủng H5N1 dưới dòng Phúc Kiến tại Việt Nam, đã và đang làm phức tạp thêm vấn đề dịch tễ học và quan hệ kháng nguyên và miễn dịch, do tỷ lệ tương đồng kháng nguyên HA (H5) và NA (N1) thấp so với các chủng phân dòng Quảng Đông, tuy nhiên vẫn còn có khả năng bảo vệ miễn dịch [1].

Vấn đề chẩn đoán và xây dựng phương pháp phát hiện nhanh và phân biệt cúm A với các tác nhân gây triệu chứng hô hấp khác, cũng như phân biệt các subtype HA và NA đã được các nhà khoa học Việt Nam quan tâm, kết hợp nghiên cứu với các tổ chức thế giới. Phát hiện nhanh cúm A/H5N1 và các subtype khác bao gồm việc sử dụng kháng nguyên hoặc kháng thể, hoặc sinh học phân tử đã được xây dựng thành phương pháp. Nghiên cứu vaccine và miễn dịch, các nhà khoa học Việt Nam cũng đã có những đóng góp nhất định về tạo chế phẩm kháng nguyên, tạo vaccine di truyền ngược hoặc vector tái tổ hợp trên nền virus cúm A/H5N1 của Việt Nam [1].

Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU

2.1.1. Mẫu vật

- Để thiết kế mồi chẩn đoán virus cúm A/H5N1, chúng tôi sử dụng các trình tự gen M, HA và NA của virus cúm gia cầm đã công bố trên Ngân hàng gen (GenBank).

- Để nghiên cứu tối ưu hóa phản ứng multiplex RT-PCR phát hiện cúm A/H5N1, chúng tôi sử dụng RNA virus cúm A/H5N1 do Viện Công nghệ Sinh học cung cấp. Để đánh giá độ đặc hiệu của phản ứng, chúng tôi sử dụng RNA virus A/H3, A/H1N1, cúm B do viện Vệ Sinh Dịch Tễ Trung Ương cung cấp; RNA virus A/H5 do Trung tâm chẩn đoán Thú Y Trung Ương cung cấp.

- Để thử nghiệm phản ứng multiplex RT-PCR chúng tôi sử dụng 14 mẫu dương tính với cúm A/H5N1 (Viện Vệ Sinh Dịch Tễ Trung Ương và Trung tâm chẩn đoán thú y Trung ương cung cấp) và 30 mẫu bệnh phẩm thu thập từ gia cầm bị bệnh trong các vụ dịch cúm năm 2009 ở một số tỉnh phía Bắc.

2.1.2. Hóa chất

- Hóa chất tách chiết RNA virus trong bộ sinh phẩm QIAamp viral RNA Mini Handbook for purification of viral RNA.

- Hóa chất phát hiện virus cúm A/H5N1 trong bộ sinh phẩm QIAGEN OneStep RT-PCR Kit Handbook.

- Hoá chất tạo plastmid tái tổ hợp mang gen M, HA, NA trong bộ sinh phẩm CloneJETTM PCR Cloning.

- Hoá chất tổng hợp RNA trong bộ sinh phẩm TranscriptAid T7 High Yield Transcription Kit.

- Dung dịch đê ̣m TBE 10X, agarose, loading dye 6X, 100bp DNA ladder, ethidium bromide 10mg/ml.

2.1.3. Thiết bị

- Các thiết bị dùng thu thập mẫu bệnh phẩm từ gia cầm bị bệnh: Trang bị bảo hộ cá nhân (găng tay các cỡ , khẩu trang N 95, kính bảo vệ mắt , ủng, quần áo bảo hô ̣), ống falcon 1.5 ml (đựng bệnh phẩm), catheter (lấy dịch tỵ hầu hoặc hút dịch đường hô hấp dưới), tăm bông, đè lưỡi, túi nylon, pipet 1 ml, 5 ml, đĩa petri, lọ nhựa, túi đá, hộp bảo quản lạnh, phiếu thu thập bệnh phẩm…

- Thiết bị dùng trong các xét nghiệm phát hiện virus cúm A/H5N1: Máy ly tâm (Eppendorf), pipette các loa ̣i (Eppendorf), vortex, đầu côn (filter) các loại , tube PCR (RNase free) các loại, găng tay dù ng 1 lần, máy luân nhiệt C1000 (BIORAD), Bio Safety Cabinet level 2 (BIOAIR), máy soi gel và chụp ảnh, bộ nguồn và bể điê ̣n di, khay đổ gel , bể nhuộm gel , cốc đong 500 ml, lò vi sóng , cân điê ̣n tử , nồi khử trùng,…và các phần mềm thiết kế mồi (clustal X 2.0.11, fastPCR 5.4, BioEdit).

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Chọn mẫu 2.2.1. Chọn mẫu

Cách chọn mẫu:

Khi có di ̣c h cúm xảy ra , đối với mỗi đàn gia cầm chúng tô i sẽ cho ̣n ngẫu nhiên từ 2-3 con gia cầm chết hoă ̣c bi ̣ bê ̣nh để lấy mẫu . Mẫu bê ̣nh phẩm thu thâ ̣p có thể là m ẫu mô (khí quản, phổi, ruột, lách, thận, não, gan, tim) hoặc dịch ngoáy họng, ổ nhớp. Bệnh phẩm được thu thập trong vòng 3 ngày đầu sau khi gia cầm mắc bệnh vì khi đó sẽ có mật độ virus cao nhất.

2.2.2. Kỹ thuật lấy mẫu, bảo quản và vận chuyển mẫu

Cách lấy mẫu:

- Mẫu ngoáy họng hoặc mẫu ổ nhớp: Đưa tăm bông mềm vào vùng ho ̣ng hoă ̣c ổ nhớp của gia cầm , ngoáy kỹ vùng định lấy mẫu . Nếu lấy mẫu ngoáy ho ̣ng , cần đưa đầu tăm bông vào đến khí quản để lấy được di ̣ch trong đường hô hấp . Sau đó đưa đầu tăm bông vào tu be chứa 3 ml môi trường vâ ̣n chuyển và nh úng kỹ trong môi trường vâ ̣n chuyển . Nhấc đầu tăm bông lên khỏi môi trường , ép nhẹ vào thành tube để lươ ̣ng di ̣ch còn la ̣i ở đầu tăm bông xuống hết.

- Mẫu mô: Đối với gia cầm chết hoặc bị bệnh , tiến hành mổ gia cầm và thu thâ ̣p mẫu mô (phổi, khí quản, ruô ̣t...) và cho vào tu be chứa môi trường vâ ̣n chuyển virus.

Bảo quản mẫu: Các mẫu bệnh phẩm sau khi thu thập được bảo quản bằng đá lạnh và v ận chuyển về phòng thí nghiệm ngay trong vòng 48 giờ. Nếu không v ận chuyển đươ ̣c mẫu về phòng thí nghiệm trước 48 giờ thì bảo quản ở -20o

C hoặc -70oC. Khi vận chuyển, mẫu vẫn giữ ở trạng thái đông băng.

Vận chuyển mẫu về phòng thí nghiệm:

Bê ̣nh phẩm trước khi vâ ̣n chuyển được đóng gói kỹ trong 3 lớp nhằm bảo vê ̣ bê ̣nh phẩm trong quá trình vâ ̣n chuyển : Vă ̣n chă ̣t nắp tube bê ̣nh phẩm , bọc kỹ miê ̣ng tube bằng giấy parafi n, bọc riêng từng tube bệnh phẩm bằng giấy thấm , đă ̣t tube vào túi nylon vâ ̣n chuyển , buô ̣c chă ̣t . Tiếp tu ̣c bo ̣c bên ngoài túi vâ ̣n chuyển bằng giấy thấm hoă ̣c bông thấm nước , cho vào mô ̣t túi nylon khác và buô ̣c chă ̣t . Phiếu thu thâ ̣p bê ̣nh phẩm được cho cùng với túi bê ̣nh phẩm vào lớp túi nylon thứ 3, buô ̣c chă ̣t . Cho các tú i bê ̣nh phẩm đã đóng gói kỹ vào hô ̣p bảo quản la ̣nh và vâ ̣n chuyển về phòng thí nghiê ̣m.

2.2.3. Tách chiết RNA mẫu bệnh phẩm

Xử lý mẫu

- Đối với mẫu mô: Mẫu bệnh phẩm thu thâ ̣p trên gia cầm đươ ̣c cho vào tube 2 ml có nắp xoáy, bổ sung 1 ml nước tinh sa ̣ch và glass bead, lắc trên máy lắc trong 5 phút để phá vỡ tế bào và giải phóng virus. Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút và thu lấy di ̣ch nổi để tách chiết RNA.

- Đối với mẫu ngoáy ho ̣ng và ngoáy hậu môn được cho v ào tu be có chứa dung di ̣ch vâ ̣n chuyển virus . Các mẫu được lắc kỹ bằng vortex , ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút, thu di ̣ch nổi để tách chiết RNA.

Tách chiết RNA

Sử du ̣ng 0.14 ml di ̣ch nổi bệnh phẩm đã xử lý để tách chiết RNA bằng bô ̣ sinh phẩm QIAamp viral RNA mini spin protocol.

Trước khi tách chiết, kiểm tra và chuẩn bị các loại hóa chất theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Và các bước tách chiết như sau:

- Hút 560 μl dung di ̣ch buffer AVL/Carrier RNA vào tube ly tâm 1.5 ml.

- Thêm 140 μl bê ̣nh phẩm đã đư ợc xử lý vào tube chứa buffer AVL/Carrier RNA. Trộn kỹ bằng vortex trong 15 giây.

- Để ở nhiê ̣t đô ̣ phòng (15-25°C) trong 10 phút để virus bị phân giải hoàn toàn, ly tâm nhẹ để tâ ̣p trung dung di ̣ch xuống đáy tube .

- Thêm 560 μl ethanol (96-100%) vào tube, trộn bằng vortex trong 15 giây, ly tâm nhe ̣ để tâ ̣p trung dung di ̣ch xuống đáy tube.

- Hút 630 μl dung di ̣ch ở trên chuyển vào QIAamp spin column (đã đă ̣t sẵn trong tube 2 ml), cẩn thận tránh để ướt m iê ̣ng tube. Đóng chă ̣t nắp và ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút. Nhấc QIAamp spin column ra đă ̣t column vào mô ̣t tube 2 ml mớ i và vứt bỏ tube cũ.

- Hút số dịch còn lại vào QIAamp spin column rồi ly tâm và chuyển QIAamp spin column sang tube 2 ml mới.

- Bổ sung 500 μl buffer AW1 và ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút. Đặt QIAamp spin column vào tube 2 ml khác và vứt bỏ tube cũ.

- Đặt QIAamp spin colu mn vào 1 tube ly tâm 1.5 ml, vứt bỏ tube c ũ. Bổ sung 60 μl buffer AVE. Đóng chă ̣t nắ p, để ở nhiệt độ phòng trong 1 phút. Ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút.

RNA có thể bền vững trong vòng 1 năm khi bảo quản ở –20°C hoă ̣c –70°C.

2.2.4. Thiết kế mồi

Mồi là những đoạn oligonucleotide dài khoảng 18-30 nucleotide có trình tự bổ sung với hai đầu của đoạn DNA muốn khuếch đại. Mồi có vai trò khởi động enzyme DNA polyemerase để kéo dài chuỗi DNA đích và quyết định hiệu quả và độ chính xác của phản ứng PCR.

mồi. Các mồi thiết kế phải đặc hiệu với các gen đặc trưng cho đối tượng cần xác định. Để chẩn đoán virus cúm A/H5N1, chúng tôi tiến hành thiết kế 3 cặp mồi phát hiê ̣n 3 trình tự đặc hiệu trên 3 gen M, HA và NA bao gồm:

- Cặp mồi khuếch đa ̣i trình tự nucleotide đă ̣c hiê ̣u trên g en M của tất cả các subtype của virus cúm A.

- Cặp mồi khuếch đa ̣i trình tự nucleotide đă ̣c hiê ̣u trên gen HA của virus cúm A subtype H5 và không khuếch đại trình tự nucleotide tương đương với các subtype HA khác.

- Cặp mồi khuếch đa ̣i trình tự nucleotide đă ̣c hiê ̣u trên gen NA của virus cúm A subtype N1 và không khuếch đại trình tự nucleotide tương đương vớ i các subtype NA khác

Các cặp mồi được thiết kế dựa trên trình tự gen M, HA và NA của các chủng virus cúm A/H5N1 đã công bố trên Genbank theo các nguyên tắc nhất định về: kích thước mồi từ 18-30 nucleotide; nhiệt độ biến tính các mồi (Tm) tương đương nhau; tỷ lệ GC trong mồi từ 40-60%; trình tự nucleotide của mồi đặc hiệu với khuôn; tránh bắt cặp bổ sung của 2 hoặc nhiều hơn các nucleotide tại đầu 3’ của các mồi để giảm sự hình thành primer-dimer; các nucleotide ở đầu 3’ của mồi bắt cặp hoàn toàn đặc hiệu với trình tự đích để giảm thiểu tối đa hiện tượng bắt cặp sai; tránh 3 hoặc nhiều hơn G hoặc C tại đầu 3’ liền nhau; tránh trình tự bắt cặp bổ sung bên trong mỗi mồi và giữa các mồi; chọn vị trí mồi sao cho kích thước các đoạn DNA đích nhân lên trong phản ứng multiplex RT-PCR phân biệt được trên bản điện di. Để thiết kế mồi, chúng tôi sử dụng các phần mềm chuyên dùng cho thiết kế mồi đó là FastPCR5.4, BioEdit, Clustalx2.0.11. Các bước thiết kế các cặp mồi đặc hiệu các gen M, HA và NA như sau:

+ Mở trang web của NCBI (National Center for Biotechnology Information)

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/Database/request.cgi), lựa cho ̣n các thông tin cần thiết về: loài virus (virus cúm A), vâ ̣t chủ (bất kỳ), khu vực (bất kỳ), các gen cần download (M, HA và NA), thờ i gian lưu hành, subtype (H5N1),...

+ Download các trình tự nucleotide của các gen M, HA và NA của virus đã đươ ̣c công bố trên GenB ank dưới da ̣ng FASTA file . Các chủng virus chọn để thiết kế mồi được phân lập từ nhiều đối tượng khác nhau.

+ Tiến hành so sánh các trình tự nucleotide bằng phần mềm Clustal X 2.0.11 + Phân tích kết quả so sánh bằng phần mềm BioEdit , lựa chọn các đoạn trình tự có đô ̣ lă ̣p la ̣i cao để thiết kế mồi cho các gen.

+ Phân tích các trình tự có đô ̣ lă ̣p la ̣i cao bằng phần mềm FastPCR 5.4 để lựa chọn các trình tự m ồi đặc hiê ̣u sử du ̣ng được trong cùng một phản ứng multiplex RT-PCR chẩn đoán cúm A/H5N1.

+ Kiểm tra độ đặc hiệu của các cặp mồi đã chọn bằng Primer - Blast với các trình tự DNA của virus cúm có trên ngân hàng dữ liệu gene của NCBI.

Cặp mồi thiết kế phát hiện gen M được lựa chọn từ những vùng bảo tồn trên gen M của các subtype virus cúm A khác nhau. Trong khi đó, các mồi phát hiện gen H5 và N1 được lựa chọn từ những vùng không thay đổi (ít bị đột biến) trên các trình tự gen HA và NA của virus cúm A subtype H5N1.

2.2.5. Tối ƣu phản ứng RT-PCR phát hiện từng gen M, HA và NA

Sau khi thiết kế được các cặp mồi, chúng tôi thực hiện phản ứng RT-PCR vớ i từng că ̣p mồi riêng rẽ để xác định các điều kiện (nồng đô ̣ mồi, nhiê ̣t đô ̣ và thời gian gắn mồi, thời gian kéo dài chuỗi, số chu kỳ lă ̣p la ̣i) thích hợp nhất để phát hiện được từng gen M, HA và NA của virus cúm A/H5N1. Phản ứng RT-PCR được thực hiện với bô ̣ sinh phẩm Qiagen Onestep RT-PCR, trên máy luân nhiê ̣t C 1000 (Biorad). Theo bộ sinh phẩm này, cả hai giai đoạn phiên mã ngược tạo cDNA (phản ứng RT) và giai đoạn khuếch đại (phản ứng PCR) được thực hiện trong cùng một tube phản ứng, nghĩa là sau khi cho RNA tách chiết vào tube, phản ứng phiên mã ngược sẽ được thực hiện trước nhờ enzyme Omniscript and Sensiscrip Reverse Transcriptases và tiếp đến phản ứng PCR nhờ enzyme Hot Star Taq DNA polymerase. Như vậy, tất cả các thành phần của phản ứng RT và PCR được cho vào một tube phản ứng trong cùng một lần. Thể tích của mỗi phản ứng RT-PCR thử nghiệm là 50 l bao gồm các thành phần trong bảng 2.1:

Bảng 2.1: Các thành phần của phản ứng RT-PCR

Thứ tự Sinh phẩm Thể tích (l) Nồng độ cuối

1 RNase free water 2 Qiagen Onestep RT-PCR

buffer 5X

10 1X

3 dNTP mix 10 mM each 2 0.4 mM each

4 Primer forward 10 M 5 Primer reverse 10 M 6 Qiagen Onestep RT-PCR Enzyme mix 2 7 RNase Inhibitor 40 U/l 5 – 10 U

8 RNA của A/H5N1 1 pg - 2 g

Tổng cô ̣ng 50

Chu trình nhiệt của phản ứng (bảng 2.2):