Xử lý mẫu
- Đối với mẫu mô: Mẫu bệnh phẩm thu thâ ̣p trên gia cầm đươ ̣c cho vào tube 2 ml có nắp xoáy, bổ sung 1 ml nước tinh sa ̣ch và glass bead, lắc trên máy lắc trong 5 phút để phá vỡ tế bào và giải phóng virus. Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút và thu lấy di ̣ch nổi để tách chiết RNA.
- Đối với mẫu ngoáy ho ̣ng và ngoáy hậu môn được cho v ào tu be có chứa dung di ̣ch vâ ̣n chuyển virus . Các mẫu được lắc kỹ bằng vortex , ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút, thu di ̣ch nổi để tách chiết RNA.
Tách chiết RNA
Sử du ̣ng 0.14 ml di ̣ch nổi bệnh phẩm đã xử lý để tách chiết RNA bằng bô ̣ sinh phẩm QIAamp viral RNA mini spin protocol.
Trước khi tách chiết, kiểm tra và chuẩn bị các loại hóa chất theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Và các bước tách chiết như sau:
- Hút 560 μl dung di ̣ch buffer AVL/Carrier RNA vào tube ly tâm 1.5 ml.
- Thêm 140 μl bê ̣nh phẩm đã đư ợc xử lý vào tube chứa buffer AVL/Carrier RNA. Trộn kỹ bằng vortex trong 15 giây.
- Để ở nhiê ̣t đô ̣ phòng (15-25°C) trong 10 phút để virus bị phân giải hoàn toàn, ly tâm nhẹ để tâ ̣p trung dung di ̣ch xuống đáy tube .
- Thêm 560 μl ethanol (96-100%) vào tube, trộn bằng vortex trong 15 giây, ly tâm nhe ̣ để tâ ̣p trung dung di ̣ch xuống đáy tube.
- Hút 630 μl dung di ̣ch ở trên chuyển vào QIAamp spin column (đã đă ̣t sẵn trong tube 2 ml), cẩn thận tránh để ướt m iê ̣ng tube. Đóng chă ̣t nắp và ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút. Nhấc QIAamp spin column ra đă ̣t column vào mô ̣t tube 2 ml mớ i và vứt bỏ tube cũ.
- Hút số dịch còn lại vào QIAamp spin column rồi ly tâm và chuyển QIAamp spin column sang tube 2 ml mới.
- Bổ sung 500 μl buffer AW1 và ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút. Đặt QIAamp spin column vào tube 2 ml khác và vứt bỏ tube cũ.
- Đặt QIAamp spin colu mn vào 1 tube ly tâm 1.5 ml, vứt bỏ tube c ũ. Bổ sung 60 μl buffer AVE. Đóng chă ̣t nắ p, để ở nhiệt độ phòng trong 1 phút. Ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút.
RNA có thể bền vững trong vòng 1 năm khi bảo quản ở –20°C hoă ̣c –70°C.