Để thiết kế m ồi cho gen HA của virus cúm A/H5N1, chúng tôi đã download 145 trình tự nucleotide gen HA của các chủng virus A/H5N1 (đại diê ̣n cho các khu vực trên thế giới và Viê ̣t Nam ) đã được công bố trên GenBank từ năm 2003 đến 2010. Các chủng virus A/H5N1 được sử dụng để thiết kế mồi được phân lập ở nhiều đối tượng vật chủ như gà, gà tây, vịt, ngỗng và người...
Sau khi phân tích bằng các phần mềm thiết kế mồi, chúng tôi đã lựa chọn cặp mồi khuếch đại trình tự đă ̣c hiê ̣u trên gen HA của A/H5N1 trong bảng 3.2:
Bảng 3.2: Cặp mồi phát hiện gen HA của virus cúm A/H5N1
Tên mồi Trình tự 5’-3’ Vị trí Tm %GC
DiagH5F AGTGATCAGATTTGCATTGGTTAC 46-69 54.6 37.5 DiagH5R GACCAAGAACTTTTGGGGATG 416-396 55.4 47.6
Mồi xuôi (DiagH5F) và mồi ngược (DiagH5R) được lựa cho ̣n để phát hiện gen HA của H5N1 có trình tự trùng khớp với hầu hết các chủng H 5N1 đã download, chỉ có một số chủng có sự khác biệt ở 1 - 2 nucleotide ở đầu 5’ hoă ̣c ở giữa trình tự nên cũng ít ảnh hưởng đến khả năng gắn mồi vào khuôn đích (hình 3.2):
Hình 3.2: Đặc điểm cặp mồi phát hiện gen HA của virus cúm A/H5
Mồi xuôi có kích thước 24 nucleotide, mồi ngược có kích thước 21 nucleotide. Cặp mồi này khuếch đại đoạn gen HA có kích thước 371 bp. Phân tích trên PastPCR 5.4, bản thân mỗi mồi không có nucleotide bắt cặp bổ sung nhau và giữa các mồi không tạo dimer từ giá trị độ nhạy cho phát hiện dimer từ 2 trở đi. Nếu có sự bắt cặp cũng không hoàn toàn đặc hiệu và chỉ ở đầu 5’ hoặc giữa các mồi. Tm của các mồi tương đương nhau khoảng 55oC.
Để kiểm tr a độ đặc hiệu của cặp mồi này với subtype H 5, chúng tôi đã thực hiện Primer - Blast với các trình tự DNA của virus cúm có trên ngân hàng dữ liệu gene của NCBI. Kết quả cho thấy, cặp mồi DiagH5F và DiagH5R chỉ khuếch đại đoạn DNA có kích thước 371 bp trên gen HA của tất cả các subtype virus cúm A/H5.
3.1.3. Thiết kế mồi đặc hiệu cho gen NA của virus cúm A/H5N1
Để thiết kế mồi cho gen NA của virus H5N1, chúng tôi đã download 92 trình tự nucleotide gen NA của cá c chủng virus H5N1 (đa ̣i diê ̣n cho các khu vực trên thế giới và Viê ̣t Nam ) đã được công bố trên GenBank từ năm 2003 đến 2010. Các chủng virus A/H5N1 được sử dụng để thiết kế mồi được phân lập ở nhiều đối tượng vật chủ như gà, gà tây, vịt, ngỗng và người...
Các trình tự gen NA này được so sán h bằng phần mềm Clustal X2.0.11, phân tích kết quả so sánh bằng phần mềm BioEdit và FastPCR 5.4. Chúng tôi đã lựa chọn được cặp khuếch đa ̣i trình tự đă ̣c hiê ̣u trên gen NA của H5N1 trong bảng 3.3: Bảng 3.3: Cặp mồi phát hiện gen NA của virus cúm A/H5N1
Tên mồi Trình tự 5’-3’ Vị trí Tm %GC
DiagN1F CCAGTTGGTTGACAATTGGAAT 503-524 54.5 40.9 DiagN1R GCATCAGGATAACAGGAGCA 794-775 55.4 50.0
Các mồi xuôi (DiagN1F) và mồi ngược (DiagN1R) đươ ̣c lựa cho ̣n để khuếch đa ̣i gen NA của H 5N1 có trình tự trùng khớp với hầu hết các chủng H 5N1 đã download, chỉ có một số chủng có sự khác biệt ở 1-2 nucleotide ở đầu 5’ hoă ̣c ở giữa trình tự nên cũng ít ảnh hưởng đến khả năng gắn mồi vào khuôn đích (hình 3.3).
Hình 3.3: Đặc điểm cặp mồi phát hiện gen NA của virus cúm A/N1
Phân tích kết quả so sánh trên FastPCR cho thấy, mồi xuôi (22 nucleotide) và mồi ngược (20 nucleotide) có Tm tương đương nhau khoảng 55oC. Không có sự tạo dimer giữa các mồi. Cặp mồi khuếch đại đoạn DNA có kích thước 292 bp.
Để kiểm tra xem cặp mồi này có đặc hiệu với N 1 hay không , chúng tôi đã thực hiện Primer- Blast với các trình tự DNA của virus cúm A có trên Genbank. Kết
quả cho thấ y cặp mồi này chỉ khuếch đại đoạn gen NA có kích thước 292 bp của virus cúm A/N1.
Như vậy, sau khi phân tích các trình tự gen H 5, N1 và M của virus cúm A đã công bố trên GenBank bằng các phần mềm chuyên du ̣ng , 3 că ̣p mồi đã được thiết kế để thực hiện phản ứng RT-PCR phát hiê ̣n virus cúm A/H5N1 trong bảng (3.4):
Bảng 3.4: Trình tự các mồi được lựa chọn để thực hiện phản ứng RT-PCR
Tên mồi Trình tự 5’-3’ Vị trí Kích thước (bp) Tm (oC) DiagMF GTCTTCTAACCGAGGTCGAAAC 5-26 154 55.1 DiagMR GTGACAGGATTGGTCTTGTCTT 158-139 55.8 DiagH5F AGTGATCAGATTTGCATTGGTTAC 46-69 371 54.6 DiagH5R GACCAAGAACTTTTGGGGATG 416-396 55.4 DiagN1F CCAGTTGGTTGACAATTGGAAT 503-524 292 54.5 DiagN1R GCATCAGGATAACAGGAGCA 794-775 55.4
Phân tích đồng thời cả 3 cặp mồi này trên FastPCR 5.4 cho thấy, các cặp mồi có nhiệt độ biến tính (Tm) tương đương nhau, các mồi không bắt cặp bổ sung nhau tạo primer – dimer nên không giảm khả năng gắn mồi với gen đích khi tất cả các mồi được cho vào cùng một phản ứng. Và mỗi cặp mồi chỉ đặc hiệu với gen tương ứng và kích thước các đoạn khuếch đại phân biệt nhau trên bản gel điện di nên chúng tôi sử dụng 3 cặp mồi này trong phản ứng multiplex RT-PCR để xây dựng quy trình chẩn đoán cúm A/H5N1.