sạch ảnh hưởng tới hiệu suất tinh sạch
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng 2 phương thức biến tính và không biến tính để thu nhận dạng hòa tan của cecropin dung hợp. Trường hợp protein dung hợp được biểu hiện ở dạng tan thì không cần xử lý biến tính nên được sử dụng trực tiếp để tinh sạch. Điển hình là
trường hợp của GST-Md-Cec được tinh sạch bằng cột sắc ký ái lực Glutathione Sepharose 4B [34]. Trong khi đó, phương thức biến tính được tiến hành khi protein dung hợp biểu hiện ở dạng thể vùi. Để thu được protein dung hợp dạng hòa tan cho khâu tinh sạch thì phải sử dụng đến các chất biến tính như ure, sarkozyl, guanidine, DTT, ... Đây chính là trường hợp biểu hiện protein Mdc-hly (loại protein lai giữa cecropin từ Musca domestica và lysozyme của người). Protein dung hợp Trx-6His-Mdc-hly ở dạng thể vùi được làm tan bằng ure 8 M; protein dung hợp này sau đó được tinh sạch bằng HisTrap kit (GE Healthcare) [36]. Trong nghiên cứu của mình, chúng tôi nhận thấy kết quả tinh sạch cecropin dạng hòa tan theo 2 phương thức biến tính và không biến tính có sự khác biệt rõ rệt. Lượng cecropin dung hợp GST-cecropin tinh sạch thu được nhờ làm tan biến tính bằng ure ít hơn hẳn so với Trx- cecropin được làm tan bằng phương pháp không biến tính. Kết quả này một phần là do sau khi GST-cecropin được làm tan bằng ure, chúng tôi phải tiến hành loại bỏ ure bằng thẩm tách trước khi tinh sạch qua cột. Tuy nhiên, sau thẩm tách thì hơn nửa GST-cecropin trở về dạng không tan. Chính vì vậy mà lượng GST-cecropin còn lại để dùng cho tinh sạch ít hơn hẳn ban đầu. Kết quả này cho thấy khi có mặt chất biến tính ure thì GST-cecropin ở dạng tan, nhưng khi loại bỏ ure thì phần lớn cecropin dung hợp lại trở về dạng không tan. Chúng tôi thay đổi hướng tinh sạch từ không biến tính (tức là ure bị loại bỏ trước khi tiến hành tinh sạch) sang biến tính (giữ nguyên ure rồi tiến hành tinh sạch). Tuy nhiên, sự thay đổi này không thành công bởi sau tinh sạch theo hướng biến tính chúng tôi không thể thu được băng GST-cecropin nào.
Khi sử dụng 2 loại chất biến tính là ure và SDS để xử lý GST-cecropin dạng thể vùi, kết quả cho thấy có sự khác biệt về mức độ ảnh hưởng của 2 loại chất biến tính này đến cấu trúc của cecropin dung hợp. Mặc dù xử lý với SDS 0.5% giúp GST-cecropin tan nhiều hơn so với ure 8 M nhưng kết quả tinh sạch thu được thì hoàn toàn ngược lại. Sau khi xử lý với SDS 0.5% dù được tiến hành tinh sạch theo hướng không biến tính (loại SDS trước khi tinh sạch) hay
biến tính (giữ nguyên SDS) đều không thu được GST-cecropin. Như vậy, GST-cecropin dù làm tan bằng ure hay SDS mà tinh sạch theo hướng biến tính thì đều không thu được kết quả. Điều này có thể giải thích là do GST trong điều kiện biến tính với SDS không còn giữ được cấu trúc để có thể liên kết được với glutathione ở cột gel sắc ký ái lực nữa nên dẫn đến không thể tinh sạch được GST-cecropin. Khi sử dụng ure 8 M để xử lý GST-cecropin dạng thể vùi, sau đó loại bỏ ure trước khi tinh sạch thì vẫn thu được GST-cecropin dù hiệu suất không cao. Điều này chứng tỏ sau khi loại bỏ ure, GST vẫn còn giữ được cấu trúc đủ để liên kết với glutathione của cột gel. Kết quả này cho thấy có sự khác biệt rõ rệt khi sử dụng SDS hoặc ure để xử lý thể vùi GST-cecropin. Điều này đặt ra cho chúng tôi câu hỏi liệu có phải SDS đã làm biến tính hoàn toàn cấu trúc của GST-cecropin và không thể hồi tính lại được hay còn nguyên nhân nào khác? Để kiểm tra giả thiết này chúng tôi đã biểu hiện GST (không dung hợp với cecropin) bằng việc biến nạp vector pGEX-4T-1 vào chủng E. coli BL21 (DE3). Chúng tôi đồng thời tiến hành xử lý GST với SDS 0.5% hoặc với ure 8 M theo đúng quy trình như đã tiến hành với protein dung hợp GST-cecropin. Sau xử lý, chúng tôi tiến hành thẩm tách loại bỏ hai loại chất biến tính rồi tinh sạch qua cột. Kết quả thu được cho thấy GST xử lý với ure tinh sạch rất tốt với hiệu suất cao trong khi GST xử lý với SDS thì không tinh sạch được. Kết quả này đã chứng minh rằng giả thiết chúng tôi đã đặt ra là đúng.
Với mục đích sản xuất AMPs nói chung và cecropin nói riêng, các nhà nghiên cứu luôn mong muốn thu được protein dung hợp ở dạng tan nhằm giữ được toàn vẹn hoạt tính, giảm thời gian, chi phí tinh sạch và đạt được hiệu suất tinh sạch cao. Kết quả của chúng tôi cho thấy khi cecropin biểu hiện ở dạng tan được tiến hành tinh sạch theo hướng không biến tính thì hiệu suất tinh sạch sẽ cao hơn hẳn so với ở dạng không tan và tinh sạch theo hướng biến tính.
Khi tiến hành biểu hiện và tinh sạch đồng thời cả 3 cecropin chúng tôi nhận thấy không chỉ có sự khác biệt khi sử dụng các hệ thống biểu hiện, các Tag dung hợp khác nhau mà ngay chính các cecropin này cũng có sự khác nhau. Trường hợp cùng sử dụng loại Tag dung hợp, hệ thống biểu hiện, phương pháp xử lý như nhau xong mức độ biểu hiện và hiệu suất tinh sạch của 3 cecropin có sự khác nhau. Cụ thể là trong số 3 cecropin thì cecT luôn biểu hiện ít và khó tinh sạch hơn hẳn so với 2 loại còn lại. Điều này đặt ra cho chúng tôi câu hỏi liệu rằng sự khác biệt này có phải là do hoạt tính khác nhau của 3 cecropin có nguồn gốc khác nhau này gây ra hay không? Bởi lẽ nhiều nghiên cứu trên cecropin đã chỉ ra rằng hoạt tính của các loại cecropin khác nhau là có sự khác biệt [5, 26, 35]. Vì vậy, để có thể trả lời được câu hỏi trên, trong hướng nghiên cứu tiếp theo chúng tôi cần thu được lượng lớn cả 3 cecropin tinh sạch đã loại bỏ Tag rồi tiến hành thử hoạt tính kháng khuẩn để có những kết luận cụ thể và chính xác.
KẾT LUẬN
Tổng hợp các kết quả thu được, chúng tôi đưa ra một số kết luận sau:
1.Thiết kế thành công 3 hệ thống vector biểu hiện 3 cecropin: hệ thống pGEX- 4T-1 (pGEX-cecH, pGEX-cecN, pGEX-cecT); hệ thống pET-28a với sự có mặt đồng thời của 2 loại Tag (pET-28a-cecH, pET-28a-cecN, pET-28a-cecT) và hệ thống pET-32b (pET-32b-cecH, pET-32b-cecN, pET-32b-cecT)
2.Biểu hiện thành công:
CecH, cecN và cecT dưới dạng dung hợp với GST trong cả 2 chủng tế bào biểu hiện E. coli BL21 (DE3) và E. coli JM109
CecH và cecN dưới dạng dung hợp với 2 Tag His+GST trong chủng tế bào biểu hiện E. coli BL21 (DE3)
CecH, cecN và cecT dưới dạng dung hợp với Trx trong chủng tế bào biểu hiện E. coli BL21 (DE3)
3.Xác định được trạng thái biểu hiện của các cecropin dung hợp:
GST-cecH, GST-cecN, GST-cecT; His+GST-cecH, His+GST-cecN ở dạng thể vùi
Trx-cecH, Trx-cecN, Trx-cecT ở dạng tan
4.Làm tan thành công các cecropin dung hợp với GST dạng thể vùi bằng SDS 0.5% và ure 8 M
5.Tinh sạch thành công các cecropin dung hợp với Trx (Trx-cecH, Trx-cecN, Trx-cecT) và cecropin dung hợp với GST (GST-cecH, GST-cecN, GST-cecT) sau khi làm tan bằng ure 8 M. Hiệu suất tinh sạch cecropin dung hợp với Tag Trx cao hơn hẳn so với Tag GST
6.Bước đầu xử lý được cecropin H dung hợp với GST bằng protease thrombin.
KIẾN NGHỊ
Những kết luận thu được ở trên đã đặt ra phương hướng nghiên cứu cho chúng tôi trong thời gian tới như sau:
1.Chuẩn hóa điều kiện giải phóng 3 loại cecropin khỏi GST và Trx bằng protease tương ứng là thrombin và enterokinase
2.Loại bỏ GST và Trx để thu các cecropin tinh sạch
3.Thử hoạt tính kháng khuẩn của 3 loại cecropin: cecH, cecN và cecT trên các chủng vi sinh vật kiểm định. Từ đó đánh giá sự khác biệt về hoạt tính kháng khuẩn của 3 cecropin này cũng như sự khác biệt về hoạt tính của cùng 1 cecropin nhưng theo hai cách làm tan biến tính và không biến tính.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1.GARP-Nhóm nghiên cứu Quốc gia của Việt Nam (2010), Phân tích thực trạng: Sử dụng kháng sinh và kháng kháng sinh ở Việt Nam, Hà Nội.
2.Nguyễn Thị Thu Hường (2011), Tách dòng cecropin từ nhộng Bombyx mori và biểu hiện cecropin tái tổ hợp trong Escherichia coli, Luận văn cử nhân Sinh học, Trường đại học Khoa học Tự nhiên, Hà Nội.
Tiếng Anh
3.Arnau J., Lauritzen C., Petersen G. E., Pedersen J. (2006), “Current strategies for the use of affinity tags and tag removal for the purification of recombinant proteins”, Protein Expression and Purification, 48, pp. 1-13.
4.Boman H. G. (1995), “Peptide antibiotics and their role in innate immunity”, Annual Review of Immunology, 13, pp. 61-92.
5.Boman H. G., Faye I., Gan R., Gudmundsson G. H., Lidholm D. A., Lee J. Y., Xanthopoulos K. G. (1987), “Insect immunity-a gene system for antibacterial proteins”,
6.Bondos S. E., Bicknell A. (2003), “Detection and prevention of protein aggregation before, during, and after purification”, Analytical Biochemistry, 316, pp. 223-231.
7.Breithaupt H. (1999), “The new antibiotics”, Nature Biotechnology, 17, pp. 1165- 1169.
8.Brogden K. A. (1992), “Ovine pulmonary surfactant induces killing of Pasteurella haemolytica, Escherichia coli, and Klebsiella pneumoniae by normal serum”, Infection and Immunity, 60, pp. 5182-5189.
9.Brogden K. A. (2005), “Antimicrobial peptides: pore formers or metabolic inhibitors in bacteria?”, Nature, 3, pp. 238-250.
10. Brogden K. A., Ackermann M., McCray P. B., Jr., Tack B. F. (2003), “Antimicrobial peptides in animals and their role in host defences”, International Journal of Antimicrobial Agents, 22, pp. 465-478.
11. Brown K. L., Hancock R. E. W. (2006), “Cationic host defense (antimicrobial) peptides”, Current Opinion in Immunology, 18, pp. 24-30.
12. Bulet P., Charlet M., Hetru C. (2003), Innate Immunity, Humana Press, Totowa, pp. 89-107.
13. Bulet P., Stöcklin R. (2005), “Insect antimicrobial peptides: Structures, properties and gene regulation”, Protein and Peptide Letters, 12, pp. 3-11.
14. Bulet P., Stöcklin R., Menin L. (2004), “Anti-microbial peptides: from invertebrates to vertebrates”, Immunological Reviews, 198, pp. 169-184.
15. Callaway J. E., Lai J., Haselbeck B., Baltaian M., Bonnesen S. P., Weickmann J., Wilcox G., Lei S. P. (1993), “Modification of the C terminus of cecropin is essential for broad-spectrum antimicrobial activity”, Antimicrobial agents and Chemotherapy, 37(8), pp. 1614-1619.
16. Chen Y. Q., Zhang S. Q., Li B. C., Qiu W., Jiao B., Zhang J., Diao Z. Y. (2008), “Expression of a cytotoxic cationic antibacterial peptide in Escherichia coli using two fusion partners”, Protein Expression and Purification, 57, pp. 303-311.
17. Cromwell M. E. M., Hilario E., Jacobson F. (2006), “Protein aggregation and bioprocessing”, The AAPS Journal, 8(3), pp. E572-E579.
18. Fei D., Wei X., Xueyin D., Xianxiu X. (1999), “The terminal structure plays an important role in the biological activity of cecropin CMIV”, Science in China, 42(5), pp. 494-500.
19. Ganz T. (1999), “Defensins and host defense”, Science, 286, pp. 420-421. 20. Ganz T. (2003), “The role of antimicrobial peptides in innate immunity”,
Integrative and Comparative Biology, 43, pp. 300-304.
21. Hancock R. E. W. (1997), “Peptide antibiotics”, Lancet, 349, pp. 418-422. 22. Hancock R. E. W., Sahl H. G. (2006), “Antimicrobial and host-defense peptides as new anti-infective therapeutic strategies”, Nature Biotechnology, 24(12), pp. 1551- 1557.
23. Holak T. A., Engstrom A., Kraulis P. J., Lindeberg G., Bennich H., Jones T. A., Gronenborn A. M., Clore G. M. (1988), “The solution conformation of the antibacterial peptide cecropin A: a nuclear magnetic resonance and dynamical simulated annealing study”, Biochemistry, 27(20), pp.7620-7676.
24. Hong R. W., Shchepetov M., Weiser J. N., Axelsen P. H. (2003) “Transcriptional profile of the Escherichia coli response to the antimicrobial insect peptide Cecropin A”, Antimicrobia agents and Chemotherapy, 47(1), pp. 1-6.
25. Hongbiao W., Baolong N., Mengkui X., Lihua H., Weifeng S., Zhiqi M. (2005), “Biological activities of cecropin B-thanatin hybrid peptides”, The journal of peptide research official journal of the American Peptide Society, 66(6), pp. 382-386.
26. Hultmark D., Engstrom A., Bennich H., Kapur R., Boman H. G. (1982), “Insect immunity: isolation and structure of cecropin D and fourminor antibacterial components from cecropia pupae”, European Journal Biochemistry, 127, pp. 207-217.
27. Jan P. S., Huang H. Y., Chen H. M. (2010), “Expression of a synthesized gene encoding cationic peptide Cecropin B in transgenic tomato plants protects against bacterial diseases”, Applied and Environmental Microbiology, 76(3), pp. 769-775.
28. Jenssen H., Hamill P., Hancock R. E. W. (2006), “Peptide antimicrobial agents”, Clinical microbiology reviews, pp. 491-511.
29. Jin F., Xu X., Zhang W., Gu D. (2006), “Expression and characterization of a housefly cecropin gene in the methylotrophic yeast, Pichia pastoris”, Protein Expression and Purification, 49(1), pp. 39-46.
30. Kamysz W., Okrój M., Lukasiak J. (2003), “Novel properties of antimicrobial peptides”, Acta Biochimica Polonica, 50(2), pp. 461-469.
31. Kang C. S., Son S. Y., Bang I. S. (2008), “Biologically active and C-Amidated HinnavinII-38-Asn produced from a Trx fusion construct in Escherichia coli”, The Journal of Microbiology, 46(6), pp. 656-661.
32. Li L., Wang J. X., Zhao X. F., Kang C. J., Liu N., Xiang J. H., Li F. H., Sueda S., Kondo H. (2005), “High level expression, purification, and characterization of the shrimp antimicrobial peptide, Ch-penaeidin, in Pichia pastoris”, Protein Expression and Purification, 39, pp. 144-151.
33. Li Y. (2009), “MINIREVIEW Carrier proteins for fusion expression of antimicrobial peptides in Escherichia coli”, Biotechnology and Applied Biochemistry, 54, pp. 1-9.
34. Liang Y., Wang J. X., Zhao X. F., Du X. J., Xue J. F. (2006), “Molecular cloning and characterization of cecropin from the housefly (Musca domestica), and its expression in Escherichia coli”, Developmental and Comparative Immunology, 30, pp. 249-257.
35. Liu Z., Zhang F., Cai L., Zhao G., Wang B. (2003), “Studies on the properties of Cecropin-XJ expressed in yeast from Xinjiang silkworm”, Wei Sheng Wu Xue Bao, 43(5), pp. 635-641.
36. Lu X. M., Jin X. B., Zhu J. Y., Mei H. F., Chu F. J., Wang Y., Li X. B. (2010), “Expression of the antimicrobial peptide cecropin fused with human lysozyme in
Escherichia coli”, Applied Microbiology and Biotechnology, 87(6), pp. 2169-2178.
37. McDermott A. M. (2004), “Defensins and other antimicrobial peptides at the ocular surface”, Ocul Surf., 2(4), pp. 229-247.
38. Mookherjee N., Hancock R. E. W. (2007), “Cationic host defence peptides: innate immune regulatory peptides as a novel approach for treating infections”, Cellular and molecular life sciences, 64(7-8), pp. 922-933.
39. Melo M. N., Ferre R., Castanho M. A. (2009), “Antimicrobial peptides: linking partition, activity and high membrane-bound concentrations”, Nature Reviews, Microbiology, 7, pp. 245-250.
40. Mercado-Pimentel M. E., Jordan N. C., Aisemberg G. O. (2002), “Affinity purification of GST fusion proteins for immunohistochemical studies of gene expression”,
41. Moore A. J., Beazley W. D., Bibby M. C., Devine D. A. (1996), “Antimicrobial activity of cecropins”, Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 37, pp. 1077-1089.
42. Moore A. J., Devine D. A., Bibby M. C. (1994), “Preliminary experimental anticancer activity of cecropins”, Peptide research, 7(5), pp. 265-269.
43. Nakajima Y., Qu X.M., Natori S. (1987), “Interaction between liposomes and sarcotoxin IA, a potent antibacterial protein of Sarcophaga peregrina (flesh fly)”, The Journal of Biological Chemistry, 262, pp. 1665-1669.
44. Pryor K. D., Leiting B. (1997), “High-level expression of soluble protein in
Escherichia coli using a His6-Tag and Maltose-Binding-Protein double-affinity fusion system”, Protein Expression and Purification, 10, pp. 309-319.
45. Sallum U. W., Chen T. T. (2008), “Inducible resistance of fish bacterial pathogens to the AMPs Cecropin B”, Antimicrobial agents and Chemotherapy, 52(9), pp. 3006-3012.
46. Sambrook J., Russel D. W. (2001), Molecular cloning: A laboratory manual, 3rd Edition, Cold Spring Habor laboratory Press, New York.
47. Sarmasik A., Warr G., Chen T. T. (2002), “Production of transgenic Medaka with increased resistance to bacterial pathogens”, Marine Biotechnology, 4, pp. 310-322.
48. Sato H., Feix J. B. (2006), “Peptide–membrane interactions and mechanisms of membrane destruction by amphipathic α-helical antimicrobial peptides”, Biochimica et Biophysica Acta, 1758, pp. 1245-1256.
49. Schmitt P., Mercado L., Díaz M., Guzmán F., Arenas G., Marshall S. H. (2008), “Characterization and functional recovery of a novel antimicrobial peptide (CECdir-CECret) from inclusion bodies after expression in Escherichia coli”, Peptides, 29, pp. 512-519.
50. Serón J. M., Contreras-Moreno J., Puertollano E., Cienfuegos G. A., Puertollano M. A., Pablo M. A. (2010), “The antimicrobial peptide cecropin A induces caspase-independent cell death in human promyelocytic leukemia cells”, Peptides, 31, pp. 1494-1503.
51. Shahravan S. H., Qu X., Chan I., Shin J. A. (2008), “Enhancing the specificity of the enterokinase cleavage reaction to promote efficient cleavage of a fusion tag”,