Để có vị trí tương ứng giữa vector tách dòng và vector biểu hiện, cecH và cecN phải được chuyển từ vector tái tổ hợp pJET1.2-cecH, pJET1.2-cecN qua vector trung gian pBS (Hình 10
ở mục 2.2.1.1). Gen cecH và cecN được nhân bản từ pJET1.2-cecH và pJET1.2-cecN vớ i cặp mồi pJET1.2 F/R. Kết quả phản ứng PCR được trình bày trên Hình 12.
Hình 12. Điện di kết quả PCR nhân gen cecH và cecN từ vector tái tổ hợp pJET1.2-
cecH và pJET1.2-cecN trên gel agarose 2%. Giếng --: đối chứng âm (không có ADN khuôn); M: marker ADN 100 bp.
Đoạn gen cecH, cecN và vector pBS cùng được xử lý với 2 enzyme XbaI và XhoI. Sau xử lý, cả hai đoạn gen và vector được tinh sạch từ gel agarose bằng bộ kit QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN). Kết quả tinh sạch được trình bày trên Hình 13.
Hình 13. Điện di kết quả tinh sạch cecH, cecN trên gel agarose 2% (A) và vector pBS trên gel agarose 1% (B) sau xử lý với XbaI và XhoI. Giếng 1, 2, 3: cecH, cecN, vector pBS xử lý với XbaI và XhoI; 4: vector pBS không xử lý; M1: marker ADN 100 bp; M2: marker ADN 1 kb.
Sau xử lý và tinh sạch, cecH và cecN được nối với vector pBS nhờ enzyme T4 DNA ligase. Sản phẩm được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α và trải trên môi trường chọn lọc có bổ sung ampicilin, IPTG và X-Gal. Các khuẩn lạc trắng được sàng lọc bằng PCR với cặp mồi của vector để lựa chọn các khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp pBS-cecH và pBS-cecN. Để kiểm tra chắc chắn các dòng này mang gen cecropin, sản phẩm PCR này còn được xử lý với enzyme XbaI. Kết quả sàng lọc được thể hiện trên Hình 14.
Hình 14. Điện di kết quả sàng lọc khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp pBS-cecH và pBS-cecN
với cặp mồi vector trên gel agarose 2% (A), hoặc cắt sản phẩm PCR với enzyme XbaI trên gel polyacrylamide 12% (B và C). Giếng --: đối chứng âm (không có ADN khuôn); 1-3: các khuẩn lạc của cecH; 4, 5: các khuẩn lạc của cecN; 6, 8: sản phẩm PCR số 1, số 4 không xử lý với XbaI; 7, 9: sản phẩm PCR số 1, số 4 xử lý với XbaI; M: marker ADN 100 bp.
Kết quả thu được ở Hình 14A cho thấy cả 5 khuẩn lạc trắng đều cho băng khoảng 400 bp (gồm kích thước từ 2 đầu mồi vector đến đoạn chèn và kích thước của đoạn chèn), chứng tỏ các khuẩn lạc này đều mang đoạn chèn khoảng 200 bp phù hợp với kích thư ớc của gen cecH
và cecN. Sản phẩm PCR của 1 khuẩn lạc cecH (số 1) và 1 khuẩn lạc cecN (số 4) được xử lý với enzyme XbaI đều cho 2 đoạn có kích thước khoảng 80 bp và 320 bp đúng như tính toán (Hình 14B và 14C). Như vậy, kết quả của cả 2 phương pháp sàng lọc này chứng tỏ chúng tôi đã chuyển thành công gen cecH và cecN từ vector pJET1.2-cecH và pJET1.2-cecN vào vector pBS. Vector tái tổ hợp pBS-cecH và pBS-cecN sẽ được sử dụng để nhân bản gen cecH và
Quá trình chuy ển gen cecropin từ vector nhân dòng , qua các vector trung gian sẽ làm xuất hiê ̣n thêm m ột số nucleotide ở đầu 5’ của gen. Với mong muốn giữ nguyên vẹn trình tự của gen cecropin trong vector biểu hiện, chúng tôi phải thiết kế các mồi dùng cho phản ứng PCR để nhân gen cecropin từ các vector pBS-cecH, pBS-cecN và pCR2.1-cecT. Với mỗi hệ thống vector biểu hiện pGEX-4T-1, pET-28a và pET-32b chúng tôi lần lượt thiết kế các mồi tương ứng là pGEX-Bam-cec, pET28a-Eco-cec và pET32b-Nco-cec.
