Với mục đích thu được lượng lớn cecropin tái tổ hợp dưới dạng protein dung hợp với các đuôi Tag theo thiết kế, chúng tôi tiến hành chuẩn điều kiện biểu hiện trong cả 2 chủng E. coli
BL21 (DE3) và E. coli JM109. Các thông số biểu hiện cần tối ưu hóa đó là: thời điểm cảm ứng (OD600 của vi khuẩn), nồng độ chất cảm ứng IPTG, thời gian cảm ứng và nhiệt độ nuôi cấy. Các dải điều kiện thăm dò được trình bày trong Bảng 7.
Bảng 7. Điều kiện biểu hiện cecropin tái tổ hợp.
ứng (OD600) (mM) (giờ) (0C)
0.4 0.1 1 25
0.6 0.5 3 30
0.8 1 5 37
Qua đêm
Với mỗi cecropin nằm trong các vector biểu hiện khác nhau cũng như các hệ thống biểu hiện khác nhau đều có điều kiện biểu hiện tối ưu riêng. Cụ thể như sau:
Biểu hiện GST-cecropin
Mức độ biểu hiện của các protein dung hợp GST-cecH, GST-cecN và GST-cecT có sự khác nhau tùy thuộc vào các thông số biểu hiện nêu trong Bảng 7. Kết quả biểu hiện GST-cecH trong chủng E. coli BL21 (DE3) ở 2 thông số là nồng độ IPTG (0.5 và 1 mM) và nhiệt độ nuôi cấy (300C và 370C) được minh họa trên Hình 20. Kết quả này cho thấy GST-cecH (kích thước 32 kDa) được biểu hiện tối ưu ở nồng độ IPTG 1 mM và nhiệt độ nuôi cấy 370C.
Hình 20. Kết quả điện di protein tổng số của tế bào E. coli BL21 (DE3) mang vector pGEX-
cecH trên gel SDS-PAGE 10%. Giếng --: tế bào không cảm ứng IPTG; 1: tế bào cảm ứng 1 mM IPTG; 0.5: tế bào cảm ứng 0.5 mM IPTG; 300C: tế bào nuôi cấy ở 300C; 370C: tế bào nuôi cấy ở 370
Tương tự như vậy, lượng cecropin dung hợp GST-cecN biểu hiện tăng lên đáng kể khi nhiệt độ nuôi cấy tăng từ 300C lên 370
C. Tuy nhiên, khác với GST-cecH, khi tăng nồng độ IPTG từ 0.5 mM lên 1 mM thì lượng GST-cecN biểu hiện không thay đổi (Hình 21). Như vậy, nhiệt độ và nồng độ IPTG tối ưu cho biểu hiện GST-cecN là 370C và 0.5 mM.
Hình 21. Kết quả điện di protein tổng số của tế bào E. coli BL21 (DE3) mang vector pGEX-
cecN trên gel SDS-PAGE 10%. Giếng --: tế bào không cảm ứng IPTG; 1: tế bào cảm ứng 1 mM IPTG; 0.5: tế bào cảm ứng 0.5 mM IPTG; 300C: tế bào nuôi cấy ở 300C; 370C: tế bào nuôi cấy ở 370
C; L: protein tổng số có băng protein 33 kDa đã biết.
Hai chủng tế bào E. coli BL21 (DE3) và E. coli JM109 biểu hiện tốt GST-cecH và GST- cecN. Tuy nhiên, cả hai chủng vi khuẩn này đều biểu hiện GST-cecT rất ít dù đã thử ở nhiều điều kiện biểu hiện khác nhau (Hình 22).
Hình 22. Kết quả điện di protein tổng số của tế bào E. coli mang vector pGEX-cecT trên gel SDS-PAGE 10%. Giếng --J, --B: tế bào JM109, BL21 (DE3) không cảm ứng IPTG; J, B: tế bào JM109, BL21 (DE3) cảm ứng; 0.5: tế bào BL21 (DE3) cảm ứng 0.5 mM IPTG; 1: tế bào BL21 (DE3) cảm ứng 1 mM IPTG; 300C: tế bào BL21 (DE3) cảm ứng nuôi cấy ở 300C; 370C: tế bào BL21 (DE3) cảm ứng nuôi cấy ở 370C; M: Precision Plus Protein™ Unstained Standards Bio Rad.
Chúng tôi chọn chủng vi khuẩn E. coli BL21 (DE3) biểu hiện GST-cecN để xác định thời điểm cảm ứng. Kết quả được minh họa trên Hình 23.
Hình 23. Kết quả điện di protein tổng số của tế bào E. coli BL21 (DE3) mang vector pGEX-
cecN trên gel SDS-PAGE 10%. Giếng --: tế bào không cảm ứng IPTG; 0.8: tế bào cảm ứng ở thời điểm OD600 = 0.8; 0.4: tế bào cảm ứng ở thời điểm OD600 = 0.4; L: protein tổng số có băng protein 33 kDa đã biết.
Khi thời điểm cảm ứng với OD600 tăng từ 0.4 lên 0.8 thì lượng GST-cecN thu được giảm đi một nửa. Như vậy, thời điểm cảm ứng tối ưu cho biểu hiện GST-cecN là OD600 = 0.4.
Sau khi chuẩn các thông số biểu hiện GST-cecH, GST-cecN và GST-cecT, chúng tôi đã xác định được điều kiện tối ưu cho biểu hiện các protein dung hợp này trong cả 2 chủng tế bào biểu hiện E. coli BL21 (DE3) và E. coli JM109 (Bảng 8).
Loại GST- cecropin Thời điểm cảm ứng (OD600) Nồng độ IPTG (mM) Thời gian cảm ứng (giờ) Nhiệt độ nuôi cấy (0 C) GST-cecH 0.4 1 3 37 GST-cecN 0.4 0.5 3 37 GST-cecT 0.4 1 3 37
Với điều kiện tối ưu như trên, băng biểu hiện các GST-cecropin ở cả 2 chủng tế bào biểu hiện được trình bày trong Hình 24.
Hình 24. Kết quả điện di protein tổng số của tế bào E. coli BL21 (DE3) (A) và E. coli
JM109 (B) mang vector pGEX-cecropin ở điều kiện biểu hiện tối ưu trên gel SDS-PAGE 10%. Giếng --H, --N, --T: tế bào mang vector pGEX-cecH, pGEX-cecN, pGEX-cecT không cảm ứng IPTG; H, N, T: tế bào mang vector pGEX-cecH, pGEX-cecN, pGEX-cecT cảm ứng IPTG.
Biểu hiện cecropin dung hợp hai Tag: His+GST-cecropin
Tiến hành chuẩn các thông số biểu hiện tương tự như phần GST-cecropin, chúng tôi nhận thấy không có His+GST-cecropin nào được biểu hiện trong chủng tế bào E. coli JM109. Trong khi đó, chỉ có His+GST-cecH và His+GST-cecN (kích thước 33 kDa) có biểu hiện trong chủng tế bào E. coli BL21 (DE3), còn His+GST-cecT không biểu hiện được. Ở điều
kiện biểu hiện là: thời điểm cảm ứng ở OD600 là 0.4, nồng độ chất cảm ứng IPTG là 1 mM, với thời gian cảm ứng là 3 giờ và nuôi cấy ở 370C băng biểu hiện của His+GST-cecH và His+GST-cecN được thể hiện trong Hình 25.
Hình 25. Kết quả điện di protein tổng số của tế bào E. coli BL21 (DE3) mang vector pET- 28a-cecH (A) và pET-28a-cecN (B) ở điều kiện biểu hiện tối ưu trên gel SDS-PAGE 10%. Giếng --H, --N: tế bào mang vector pET-28a-cecH, pET-28a-cecN không cảm ứng IPTG; H, N: tế bào mang vector pET-28a-cecH, pET-28a-cecN cảm ứng IPTG; L: protein tổng số có băng protein 33 kDa đã biết.
Biểu hiện Trx+cecropin
Khi tiến hành chuẩn điều kiện biểu hiện Trx-cecH và Trx-cecN trong chủng E. coli BL21 (DE3), chúng tôi nhận thấy ở 2 nồng độ IPTG 0.5 mM và 1 mM đều thu được băng biểu hiện có kích thước khoảng 25 kDa. Đây là kích thước của băng protein dung hợp giữa Trx và cecropin. Tuy nhiên, lượng Trx-cecH và Trx-cecN được biểu hiện ở 2 nồng độ này khác nhau không đáng kể. Trong khi đó, nếu giảm nhiệt độ nuôi cấy từ 370C xuống 300C thì lượng protein dung hợp thu được giảm đáng kể (Hình 26).
Hình 26. Kết quả điện di protein tổng số của tế bào E. coli BL21 (DE3) mang vector pET- 32b-cecH và pET-32b-cecN trên gel SDS-PAGE 12%. Giếng --H, --H30, --H37: tế bào mang vector pET-32b-cecH không cảm ứng IPTG; --N, --N30, --N37: tế bào mang vector pET-32b-
cecN không cảm ứng IPTG; H1, H0.5, H30, H37: tế bào mang vector pET-32b-cecH cảm ứng ở nồng độ IPTG 1 mM, nồng độ IPTG 0.5 mM, nuôi cấy ở 300C, nuôi cấy ở 370
C; N1, N0.5, N30, N37: tế bào mang vector pET-32b-cecN cảm ứng ở nồng độ IPTG 1 mM, nồng độ IPTG 0.5 mM, nuôi cấy ở 300C, nuôi cấy ở 370
C; M: Prestained Protein Molecular Weight Marker Fermentas.
Tương tự như Trx-cecH và Trx-cecN, Trx-cecT cũng được chuẩn điều kiện biểu hiện trong chủng E. coli BL21 (DE3); tuy nhiên, lượng protein dung hợp thu được ít hơn hẳn 2 loại cecropin dung hợp ở trên (Hình 27).
Hình 27. Kết quả điện di protein tổng số của tế bào E. coli BL21 (DE3) mang vector pET- 32b-cecT trên gel SDS-PAGE 12%. Giếng --3, --5, --7, --24: tế bào không cảm ứng IPTG ở thời điểm thu mẫu 3, 5, 7, 24 giờ; 3, 5, 7, 24: tế bào cảm ứng IPTG ở thời điểm thu mẫu 3, 5, 7, 24 giờ; L: protein tổng số có băng protein 25 kDa đã biết.
Sau khi chuẩn các thông số biểu hiện như trên, chúng tôi quyết định lựa chọn điều kiện biểu hiện tối ưu cho từng Trx-cecropin trong chủng E. coli BL21 (DE3) như Bảng 9.
Bảng 9. Điều kiện tối ưu biểu hiện Trx-cecropin trong chủng E. coli BL21 (DE3).
Loại GST-cecropin Thời điểm cảm ứng (OD600) Nồng độ IPTG (mM) Thời gian cảm ứng (giờ) Nhiệt độ nuôi cấy (0 C) Trx-cecH 0.4 0.5 3 37 Trx-cecN 0.4 0.5 3 37 Trx-cecT 0.4 1 5 37
Khác với chủng E. coli BL21 (DE3), chủng E. coli JM109 không biểu hiện được bất kỳ loại Trx-cecropin nào ở các điều kiện biểu hiện khác nhau (Hình 28). Điều này cho thấy không thể sử dụng chủng này để thu protein dung hợp Trx-cecropin.
Hình 28. Kết quả điện di protein tổng số của tế bào E. coli JM109 mang vector pET-32b-
cecH và pET-32b-cecN trên gel SDS-PAGE 12%. Giếng --H, -N: tế bào mang vector pET- 32b-cecH, pET-32b-cecN không cảm ứng; H3, H5: tế bào mang vector pET-32b-cecH cảm ứng IPTG ở thời điểm thu mẫu 3, 5 giờ; N3, N5: tế bào mang vector pET-32b-cecN cảm ứng IPTG ở thời điểm thu mẫu 3, 5 giờ; L: protein tổng số có băng protein 25 kDa đã biết.