Có bốn phương pháp được ứng dụng nhiều nhất để tinh sạch protein, đó là: sắc ký lọc gel dựa vào kích thước của phân tử; sắc ký trao đổi ion dựa vào điện tích của phân tử; sắc ký ái lực dựa vào ái lực của phân tử với một loại phân tử khác và sắc ký lỏng cao áp dựa vào kích thước của phân tử. Trong đó, sắc ký ái lực là phương pháp rất hiệu quả và được ứng dụng rộng rãi. Với việc thiết kế vector biểu hiện như đã trình bày ở trên thì quá trình tinh sạch được tiến hành bằng phương pháp sắc ký ái lực. Kỹ thuật này dựa trên ái lực cao của GST Tag với cơ chất của nó là glutathione và His Tag với cơ chất là Ni2+. Các hạt gel agarose được bọc với cơ chất tương ứng là glutathione hoặc Ni2+ sẽ liên kết đặc hiệu với GST-protein và His-protein. Những hạt gel này sau đó sẽ được rửa để loại các protein tạp chất từ tế bào vi
khuẩn. Thêm cơ chất tự do vào để giải phóng protein dung hợp ra khỏi dung dịch. Sau đó tiến hành xử lý với enzyme thích hợp để thu được protein mong muốn.
Như vậy, việc sản xuất protein dạng dung hợp với đuôi ái lực như trên đã làm giảm thiểu các bước tinh sạch phức tạp, giảm ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học của protein quan tâm. Các đuôi dung hợp có thể là polypeptide, các protein nhỏ hay enzyme được thêm vào đầu N- terminal hay đầu C-terminal của protein đích. Tuy nhiên, các đặc điểm hóa sinh của các đuôi khác nhau có thể ảnh hưởng lên tính ổn định, tính tan và khả năng biểu hiện của protein được gắn với chúng. Do đó, việc lựa chọn vector biểu hiện với đuôi ái lực cần phù hợp với từng loại protein nghiên cứu và quy trình tinh sạch chúng.
Việt Nam là một trong những nước có tình trạng kháng kháng sinh cao nhất thế giới hiện nay. Việt Nam cũng là nơi côn trùng có mức độ đa dạng và phong phú vào bậc nhất thế giới. Điều này có nghĩa chúng ta đang nắm trong tay nguồn gen cecropin quý giá. Tuy nhiên, những nghiên cứu về cecropin được phân lập từ các loài côn trùng ở Việt Nam còn hạn chế. Trong những năm gần đây, nhóm nghiên cứu của Phòng thí nghiệm Sinh Y, Khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã phân lập một số gen
cecropin từ nhộng, muỗi, ruồi giấm của Việt Nam [2]. Tiếp tục sử dụng các gen cecropin đó để biểu hiện cecropin tái tổ hợp trong tế bào vi khuẩn E. coli là hướng nghiên cứu cần thiết. Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài “Tách dòng và biểu hiện cecropin trong các hệ vector khác nhau”. Ngoài ra, đề tài còn nghiên cứu với gen cecropin B được tổng hợp nhân tạo (theo dữ liệu trên ngân hàng dữ liệu) để so sánh với cecropin từ các loài côn trùng ở Việt Nam. Cecropin B được đánh giá là có hoạt tính kháng khuẩn cao nhất trong số các cecropin đã được nghiên cứu [26]. Như vậy, nghiên cứu của chúng tôi gồm hai bước chính: (1) tiến hành tách dòng (subclone) chuyển gen cecropin B tổng hợp nhân tạo và gen cecropin phân
lập từ các loài côn trùng ở Việt Nam vào các vector biểu hiện và (2) nghiên cứu để biểu hiện các loại cecropin này trong hệ thống vi khuẩn E. coli.
Như vậy, với việc nghiên cứu về cecropin được phân lập từ các loài côn trùng ở Việt Nam, đồng thời với phương pháp thu nhận peptide mong muốn bằng con đường sản xuất protein tái tổ hợp, đề tài “Tách dòng và biểu hiện cecropin trong các hệ vector khác nhau” mang nhiều ý nghĩa. Thứ nhất, đây là một trong những nghiên cứu đầu tiên về cecropin được phân lập từ các loài côn trùng ở Việt Nam. Từ đó có thể mở ra các hướng nghiên cứu nhằm đánh giá đúng tầm quan trọng nguồn gen cecropin quý giá của Việt Nam. Từ nguồn gen quý này có thể được ứng dụng thực tế trong công tác chuyển gen. Thứ hai, bằng phương pháp thu nhận cecropin tái tổ hợp giúp giảm chi phí, chủ động trong nghiên cứu và phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm tại Việt Nam. Có thể nói đây là một trong số ít nghiên cứu thu nhận peptide kháng khuẩn bằng con đường tái tổ hợp được thực hiện tại Việt Nam. Cả hai điều này đều cho thấy hướng đi của đề tài còn khá mới mẻ ở Việt Nam nhưng cũng hứa hẹn nhiều tiềm năng cho các nghiên cứu sau này.
CHƢƠNG 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
