Bên cạnh hệ thống biểu hiện, khâu lựa chọn Tag cũng là một trong những yếu tố quan trọng nhất quyết định tới kết quả biểu hiện AMPs. Do AMPs thường là các phân tử có kích thước nhỏ nên khi được biểu hiện trong tế bào rất dễ bị phân hủy bởi các protease nội bào. Hơn nữa, AMPs có hoạt tính kháng khuẩn nên chính AMPs được biểu hiện sẽ gây độc cho vi khuẩn. Mặt khác, vi khuẩn có xu hướng biểu hiện các protein tái tổ hợp mà đặc biệt là AMPs ở dạng thể vùi nhằm hạn chế tác động của protein lạ. Khi đó, tinh sạch protein dạng thể vùi trở nên phức tạp và nhiều khi ảnh hưởng tới hoạt tính của protein [16, 40]. Để khắc phục những khó khăn trên, một trong những giải pháp hiệu quả là biểu hiện AMPs dưới dạng protein dung hợp với các Tag. Trên thị trường hiện nay có nhiều loại Tag thương mại trong đó GST Tag, His Tag và Trx Tag được sử dụng rộng rãi do chúng có khả năng sản xuất AMPs tái tổ hợp, trong đó có cecropin, ở dạng tan trong E. coli [33]. Trong nghiên cứu của mình chúng tôi đã lựa chọn 3 loại Tag này để biểu hiện cecropin tái tổ hợp. Chúng tôi nhận thấy chỉ có Trx Tag là giúp biểu hiện các cecH, cecN và cecT ở dạng tan.
Khi so sánh với kết quả biểu hiện các loại protein tái tổ hợp ở vi khuẩn, chúng tôi nhận thấy với cùng 1 loại Tag nhưng tính tan của các loại protein, thậm chí của các cecropin thuộc họ cecropin là khác nhau. Khi cùng sử dụng GST Tag để biểu hiện đồng thời 2 loại protein dung hợp là GST-MAR và GST-PPAR, Shen và cs. nhận thấy có sự khác biệt về trạng thái biểu hiện. Nếu như GST-MAR được biểu hiện hoàn toàn ở dạng tan thì chỉ 46.1% GST-PPAR ở
dạng tan [52]. Tương tự như vậy, khi Mercado-Pimentel và cs. tiến hành biểu hiện đồng thời 3 protein dung hợp là GST-Lox2, GST-Lox4, GST-Lox6 thì cả 3 đều ở dạng thể vùi [40] mặc dù GST là Tag được đánh giá là có khả năng giúp protein biểu hiện ở dạng tan với mức độ cao. Các nghiên cứu về cecropin cũng thu được kết quả tương tự, Liang và cs. sử dụng hệ thống pGEX-4T-1 để biểu hiện cecropin có nguồn gốc từ Musca domestica trong E. coli
BL21 và thu được protein dung hợp GST-Md-cec ở dạng tan [34]. Tuy nhiên, Cheng và cs. tiến hành biểu hiện CM4 và CMt (loại peptide thuộc họ cecropin) nhưng protein dung hợp GST-CM4 và GST-CMt lại hoàn toàn ở trạng thái không tan. Một phần các protein dung hợp này thu được ở dạng tan khi phải sử dụng đến Tag thứ hai là intein [16]. Như vậy, trong nghiên cứu của chúng tôi, cả ba loại cecropin cecH, cecN và cecT dung hợp với GST Tag ở trạng thái không tan đơn giản chỉ là do GST không phải là Tag phù hợp với các cecropin này. Rõ ràng, không chỉ các protein khác nhau mà ngay cả các cecropin thuộc cùng họ cecropin sẽ có trạng thái biểu hiện khác nhau khi dung hợp với cùng một loại Tag.
Do GST Tag không giúp biểu hiện cecropin ở dạng tan nên chúng tôi đã tiến hành thiết kế hệ thống vector biểu hiện thứ 2 là pET-28a-cecropin. Chúng tôi đã thiết kế để cecropin được dung hợp với 2 Tag là His và GST. Phương án thiết kế này tạo thuận lợi phát hiện băng protein dung hợp trong quá trình điện di cũng như đặt hy vọng thu được cecropin ở dạng tan khi sử dụng hai loại Tag. Không những thế, việc sử dụng nhiều Tag để biểu hiện protein tái tổ hợp còn là một giải pháp nhằm giúp biểu hiện các protein khó biểu hiện, làm tăng khả năng tan của protein dung hợp và tăng hiệu quả tinh sạch [44, 56]. Điển hình là nghiên cứu của Pryor và cs. khi tiến hành thiết kế 2 loại Tag MBP (maltose-binding protein) và His để biểu hiện penicillin-binding protein PBP2a và UDP-N-acetylmuramate: L-alanine ligase (MurC). Kết quả thu được cho thấy khả năng biểu hiện các protein này ở dạng tan và hiệu suất tinh sạch cao hơn các hệ thống vector biểu hiện khác [44]. Trong nghiên cứu của chúng tôi, sự có mặt đồng thời của hai loại Tag His và GST cho phép sử dụng cả 2 loại cột tinh sạch sắc ký ái
lực là Glutathione Sepharose 4B và Ni-NTA agarose; như vậy sẽ giúp tinh sạch cecropin tốt hơn. Tuy nhiên, kết quả thu được không như mong đợi bởi cecropin vẫn biểu hiện ở dạng thể vùi. Đặc biệt, khi xử lý với ure 8 M, các dạng thể vùi này còn khó tan hơn so với khi chỉ dung hợp với một loại GST Tag. Hình 30 trong phần kết quả cho thấy ure 8 M làm tan một nửa GST-cecropin nhưng không thể làm tan được His+GST-cecropin. Kết quả này càng khẳng định vai trò của Tag đến trạng thái biểu hiện của cecropin và đồng thời cũng đặt ra thách thức cho chúng tôi nếu còn muốn có được lợi thế khi sử dụng đồng thời hai loại Tag là His và GST như đã trình bày ở trên. Sử dụng chất biến tính khác như Sarcozyl, Guanidine hoặc phải thay đổi điều kiện biểu hiện là hướng nghiên cứu tiếp theo mà chúng tôi mong muốn thu được His+GST-cecropin ở dạng tan.
Khi sử dụng hệ thống vector biểu hiện pET-32b-cecropin với loại Tag Trx thì chúng tôi thu được cecropin dung hợp ở trạng thái tan. Đây là loại Tag được đánh giá có khả năng giúp protein biểu hiện ở dạng tan cao [33, 66]. Nhiều nghiên cứu biểu hiện AMPs dung hợp với loại Tag này đã thu được kết quả khả quan. Điển hình như nghiên cứu của Xu và cs. đã thu nhận cecropin Mdmcec dung hợp với Trx Tag ở dạng tan [66]. Tuy nhiên, Lu và cs. đã không thành công khi biểu hiện Trx-Mdc-hly (một peptide lai giữa cecropin (Mdc) với lysozyme của người (hly)) trong E. coli BL21 (DE3). Protein dung hợp Trx-Mdc-hly thu được toàn bộ ở dạng thể vùi [36]. Kết quả này một lần nữa càng khẳng định rằng việc lựa chọn Tag để thu được AMPs dung hợp ở trạng thái tan phụ thuộc rất nhiều vào loại peptide nghiên cứu.