3.1.1. Kiểm tra DNA tổng số
Trong nghiên cứu này, các mẫu yến đƣợc sử dụng bao gồm mẫu cơ và mẫu lơng. DNA từ mẫu cơ đƣợc tách chiết bằng Chelex 10%, từ mẫu lơng đƣợc tách bằng bộ kit Magazorb® DNA Mini-Prep Kit theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất. Sản phẩm tách chiết sau đĩ đƣợc điện di trên gel agarose để kiểm tra chất lƣợng DNA tách chiết đƣợc. Kết quả điện di nhƣ sau:
Hình 3.1: Kết quả điện di DNA tổng tách chiết từ mẫu lơng (hình trái) và mơ cơ (hình phải) chim yến Cơn Đảo.
Kí hiệu trong ảnh:
- 1, 2, 3, 4, 5, 6: Các mẫu chim yến. - MK: Thang chỉ thị (Marker).
Theo hình 3.1 cho thấy quá trình tách chiết DNA thành cơng với nồng độ DNA cao (ảnh phải). Tuy nhiên lƣợng DNA bị đứt gãy khá nhiều (ảnh phải), nguyên nhân cĩ thể là do phƣơng pháp tách chiết bằng Chelex 10% cĩ sử dụng thời gian ủ mẫu ở nhiệt độ 95oC khá lâu, do đĩ làm đứt gãy các đoạn DNA kích thƣớc lớn. Tuy nhiên sử dụng các mẫu tách chiết này để thực hiện phản ứng khuếch đại PCR vẫn cho kết quả tốt. Đối với ảnh trái, lƣợng DNA thu đƣợc rất thấp, các mẫu gần nhƣ khơng thấy sự xuất hiện của DNA. Do đĩ khi tiến hành PCR, lƣợng DNA mẫu lấy từ mẫu tách chiết từ lơng luơn cao hơn so với mẫu tách từ mơ cơ.
3.1.2. Kết quả thực hiện phản ứng PCR
Kết quả phản ứng PCR đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose:
Hình 3.2: Kết quả điện di sản phẩm PCR từ mẫu lơng yến Cơn Đảo.
Kí hiệu: - 1: Y01CD - 2: Y04CD - 3: Y12CD - 4: Y14CD - 5: Y16CD - MK: thang chỉ thị (Marker). 700bp
Từ kết quả điện di trên cho thấy quá trình thực hiện PCR cho ra kết quả tốt. Sản phẩm PCR sau đĩ đƣợc bảo quản ở nhiệt độ -40oC chuẩn bị tiếp cho quá trình giải trình tự ở giai đoạn sau.
3.1.3. Giải trình tự Cytb mtDNA của chim yến
Sản phẩm PCR đƣợc tiến hành đĩng gĩi, kí hiệu và kiểm tra cẩn thận, sau đĩ đƣợc gửi đến cơng ty Nam Khoa (Tp. Hồ Chí Minh) để tiến hành giải trình tự.
3.1.4. Xử lý kết quả giải trình tự
Hình 3.3: Giao diện sử dụng phần mềm sequencher trong quá trình xử lý trình tự thơ.
Kết quả quá trình xử lý thơ trình tự: các trình tự đều mang thơng tin sạch, đủ điều kiện thực hiện các cơng đoạn tiếp theo.
3.1.5. Kết quả xây dựng cây phát sinh lồi
Sau khi đã xử lý thơ các trình tự trên, phần mềm MEGA5 v.5.2 (Tamura và cs., 2011) tiếp tục đƣợc sử dụng để thực hiện các thao tác: giĩng hàng, cắt bỏ các đoạn nucleotide thừa, xây dựng cây phát sinh lồi.
Kết quả phân tích đối với dữ liệu trình tự gen Cytb mtDNA dựa trên phƣơng pháp MP, NJ và ML cho kết quả về cây phát sinh lồi đƣợc trình bày ở hình 3.4 (khơng sử dụng nhĩm ngoại và các trình tự tải về từ GenBank) và hình 3.5 (cĩ sử dụng nhĩm ngoại và các trình tự tải về từ GenBank) với giá trị BT của các thuật tốn MP, NJ và ML lần đƣợc biểu hiện trên các nhánh (MP/NJ/ML). Nhĩm ngoại đƣợc sử dụng trong việc xây cây phát sinh lồi này là lồi A. terraereginae (Lee và cs., 1996) (hình 3.5).
Đối với cây phát sinh lồi chỉ dùng các trình tự từ nghiên cứu hiện tại, các trình tự đều đạt kích thƣớc 691bp. Tuy nhiên khi giĩng hàng với các trình tự từ GenBank, chỉ cịn 567bp đƣợc sử dụng.
Hình 3.4: Cây phát sính lồi dựa trên gen Cytb mtDNA của chim yến Aerodramus fuciphagus thu tại Việt Nam. Các giá trị bootstrap (phân tích MP, NJ và ML) đƣợc biểu thị trên các nhánh (MP/NJ/ML).
Nhĩm 2.2.1
Nhĩm 2.2.2
Qua hình 3.4 cho thấy, trên cây phát sinh lồi xuất hiện 2 nhĩm lớn:
Nhĩm 1: Gồm các mẫu yến Trảng Bom – Đồng Nai, Kiên Giang, yến nhà Khánh Hịa và các mẫu yến từ Malaysia (A. f. amechanus, A. f. germani), Indonesia (A.
f. vestitus). Nhĩm này phân tách thành 2 nhĩm nhỏ hơn là nhĩm 1.1 và 1.2. Nhĩm 1.1
cĩ sự hiện diện của cả các mẫu yến từ Trảng Bom – Đồng Nai, Kiên Giang và yến nhà Khánh Hịa (giá trị BT: 88/87/85). Trong nhĩm 1.1 lại đƣợc chia thêm một nhĩm nhỏ hơn (nhĩm 1.1.1) với sự hiện diện của các mẫu từ Trảng Bom – Đồng Nai và Khánh Hịa (yến nhà). Nhĩm 1.2 cĩ sự xuất hiện của các mẫu yến Trảng Bom – Đồng Nai và Kiên Giang (giá trị BT: 93/88/94). Ngồi ra trong nhĩm này cĩ sự xuất hiện của 01 mẫu yến nhà ở Khánh Hịa.
Nhĩm 2: Gồm các mẫu yến Khánh Hịa (yến đảo và yến nhà) và yến Cơn Đảo. Nhĩm này phân tách này 2 nhĩm nhỏ hơn là nhĩm 2.1 và 2.2. Trong nhĩm 2.1 chỉ hiện diện các mẫu yến từ Cơn Đảo, nhĩm này phân tách rõ ràng với nhĩm 2.2. Trong nhĩm 2.2 bao gồm cả yến Khánh Hịa (yến đảo và yến nhà) và yến Cơn Đảo. Trong nhĩm này cĩ sự phân tách thành 2 nhĩm nhỏ hơn, tạo thành nhĩm 2.2.1 và nhĩm 2.2.2. Nhĩm 2.2.1 chỉ gồm các mẫu yến Khánh Hịa, trong đĩ số lƣợng mẫu yến nhà Khánh Hịa nhiều hơn. Nhĩm 2.2.2 gồm cả yến Khánh Hịa và yến Cơn Đảo, trong đĩ yến nhà Khánh Hịa chỉ hiện diện 2 mẫu. Nhƣ vậy, đây cĩ thể là sự phân tách giữa nhĩm yến nhà và yến đảo.
Kết quả trên đây đƣợc thành lập khi khơng sử dụng các trình tự của các lồi A. f.
germani, A. f. vestitus, A. f. amechanus cũng nhƣ nhĩm ngoại lấy từ GenBank. Khi sử
dụng kết hợp cả các trình tự này, kết quả xây dựng cây phát sinh lồi cĩ thay đổi nhƣ sau (hình 3.5): (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 3.5: Cây phát sinh lồi dựa trên gen Cytb mtDNA của chim yến Aerodramus fuciphagus thu tại Việt Nam. A. terraereginae đƣợc sử dụng làm nhĩm ngoại (Lee và cs., 1996). Các giá trị bootstrap (phân tích MP, NJ và ML) đƣợc
Qua hình 3.5 cho thấy, trên cây phát sinh lồi xuất hiện 3 nhĩm lớn:
Nhĩm 1: Bao gồm các mẫu yến Khánh Hịa (yến nhà và yến đảo) và yến Cơn Đảo (giá trị BT: 95/95/99). Trong nhĩm này khơng thấy sự hiện diện của các mẫu trình tự tải về từ GenBank. Cấu trúc nhĩm này tƣơng tự nhƣ nhĩm 2 của hình 3.4.
Nhĩm 2: Bao gồm các mẫu yến Trảng Bom – Đồng Nai và Kiên Giang (giá trị BT: 93/95/94). Trong nhĩm này cĩ sự hiện diện của các phân lồi A. f. amechanus và
A. f. vestitus tải về từ GenBank. Về cấu trúc, nhĩm này tƣơng tự với nhĩm 1.2 của hình
3.4. Tuy nhiên ở hình này, vị trí của nhĩm đã đƣợc dịch chuyển về gần với nhĩm yến Khánh Hịa hơn so với hình 3.4.
Nhĩm 3: Bao gồm các mẫu yến Trảng Bom – Đồng Nai, Kiên Giang và các phân lồi A. f. amechanus, A. f. germani, A. f. vestitus tải về từ GenBank.
Nhƣ vậy, qua hình ảnh của cây phát sinh lồi cho thấy sự phân tách rõ ràng các mẫu yến theo khu vực địa lý khi khơng cĩ sự hiện diện của các trình tự tải về từ GenBank hay nhĩm ngoại. Các mẫu yến Trảng Bom – Đồng Nai và Kiên Giang cĩ sự phân tách rõ ràng đối với các mẫu yến Khánh Hịa, đặc biệt là các mẫu yến Kiên Giang (khơng cĩ mẫu Kiên Giang nào xuất hiện trong nhánh tập trung nhiều mẫu yến Khánh Hịa).
Theo hình 3.5, các mẫu yến Kiên Giang cĩ khả năng là phân lồi A. f. amechanus (giá trị BT: 67/61/65) trong khi mẫu chim yến tại Trảng Bom – Đồng Nai
cĩ khả năng là phân lồi A. f. vestitus (giá trị BT: 93/95/94), tuy nhiên kết quả chƣa
thật sự rõ ràng vì sự xuất hiện của các mẫu từ Khánh Hịa trong nhĩm yến Trảng Bom – Đồng Nai.
Yến Cơn Đảo và yến đảo Khánh Hịa cĩ khả năng là các phân lồi gần gũi với nhau. Sự phân tách giữa yến nhà và yến đảo Khánh Hịa rõ ràng, và giống với kết quả nghiên cứu của Phan Thị Huyền Trân và cs. (2012).
3.1.6. Đa dạng haplotype và xây dựng mạng lƣới haplotype
Các trình tự của chim yến (bao gồm cả các trình tự lấy từ GenBank, khơng bao gồm nhĩm ngoại) sau khi đƣợc giĩng hàng và cắt bỏ các đoạn nucleotide thừa, đƣợc chuyển sang phần mềm DnaSP v.5.10 (Rozas và cs., 2003) để thực hiện các tính tốn về đa dạng haplotype. Kết quả nhƣ sau:
a. Khảo sát đa dạng haplotype riêng cho từng khu vực:
- Trong số 29 trình tự mtDNA (691 bp) từ các mẫu yến Khánh Hịa (yến đảo và yến nhà) quan sát thấy cĩ 7 haplotype (H = 7) với đa dạng haplotype Hd = 0,722±0,057, đa dạng nucleotide π = 0,00563, số lƣợng vị trí đa hình (polymorphic sites) S = 15, số đột biến η = 16, số nucleotide khác biệt trung bình k = 3,892.
- Trong số 17 trình tự mtDNA (691 bp) từ các mẫu yến Trảng Bom – Đồng Nai quan sát thấy cĩ 5 haplotype (H = 5) với đa dạng haplotype Hd = 0,581±0,131, đa dạng nucleotide π = 0,00321, số lƣợng vị trí đa hình (polymorphic sites) S = 13, số đột biến η = 13, số nucleotide khác biệt trung bình k = 2,221.
- Trong số 17 trình tự mtDNA (691 bp) từ các mẫu yến Kiên Giang quan sát thấy cĩ 2 haplotype (H = 2) với đa dạng haplotype Hd = 0,441±0,098, đa dạng nucleotide π = 0,00319, số lƣợng vị trí đa hình (polymorphic sites) S = 5, số đột biến η = 5, số nucleotide khác biệt trung bình k = 2,206.
- Trong số 12 trình tự mtDNA (691 bp) từ các mẫu yến Cơn Đảo quan sát thấy cĩ 3 haplotype (H = 3) với đa dạng haplotype Hd = 0,530±0,136, đa dạng nucleotide π = 0,00164, số lƣợng vị trí đa hình (polymorphic sites) S = 3, số đột biến η = 3, số nucleotide khác biệt trung bình k = 1,136.
b. Khảo sát đa dạng haplotype cho chất cả các mẫu:
- Trong số 75 trình tự gen thu đƣợc ở Khánh Hịa, Cơn Đảo, Trảng Bom – Đồng Nai (tất cả đều là 691 bp), quan sát thấy cĩ 12 haplotype (H = 12) với đa dạng
haplotype Hd = 0,798±0,028, đa dạng nucleotide π = 0,00812, số lƣợng vị trí đa hình (polymorphic sites) S = 18, số đột biến η = 20, số nucleotide khác biệt trung bình k = 5,614.
- Khi sử dụng 75 trình tự gen thu đƣợc ở Khánh Hịa, Cơn Đảo, Trảng Bom – Đồng Nai và Kiên Giang và 9 trình tự từ Genbank (tất cả đều là 622 bp), quan sát thấy cĩ 13 haplotype (H = 13) với đa dạng haplotype Hd = 0,799±0,028, đa dạng nucleotide π = 0,00823, số lƣợng vị trí đa hình (polymorphic sites) S = 18, số đột biến η = 20, số nucleotide khác biệt trung bình k = 5,121.
- Trong tổng số 13 haplotype thì yến Khánh Hịa cĩ mặt trong 7 haplotype, Cơn Đảo cĩ trong 3 haplotype, Trảng Bom cĩ trong 5 haplotype và Kiên Giang cĩ trong 2 haplotype. Haplotype chung (ancestor haplotype) đƣợc chia sẻ bởi các quần thể, bao gồm Trảng Bom – Đồng Nai (11), Kiên Giang (12), yến Nhà Khánh Hịa (2), A. f. amechanus (2), A. f. germani (2), A. f. vestitus (1). Các
trình tự sử dụng đều thuộc về lồi chim yến A. fuciphagus nên các cá thể ở khu vực Trảng Bom – Đồng Nai, Kiên Giang và yến nhà Khánh Hịa cũng nhƣ các trình tự yến lấy từ Genbank (nguồn gốc từ Malaysia và Indonesia) chia sẻ 1 haplotype tổ tiên. Tuy nhiên, quần thể yến đảo Khánh Hịa và Cơn Đảo khơng cĩ sự hiện diện của haplotype này.
Bảng 3.1: Các giá trị phân tích Cytb mtDNA chim yến Aerodramus spp.
Vùng thu mẫu
( hoặc Nghiên cứu) S
Đa dạng di truyền k η Hd π Khánh Hịa (691bp) 29 15 3,892 16 0,722±0,057 0.00563 Khánh Hịa (155 Thống Nhất, Nha Trang) (691 bp) 16 14 5,550 15 0,742±0,104 0.00803 Khánh Hịa (Đảo A2, A6) (691bp) 13 2 0,615 2 0,564±0,112 0.00089
Trảng Bom – Đồng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nai (691bp) 17 13 2,221 13 0,581±0,131 0,00321 Kiên Giang (691bp) 17 5 2,206 5 0,441±0,098 0,00319 Cơn Đảo (691bp) 12 3 1,136 3 0,530±0,136 0,00164 Nghiên cứu hiện tại
(691bp) 75 18 5,614 20 0,798±0,028 0,00812
Nghiên cứu hiện tại
(622bp) 75 18 5,121 20 0,799±0,028 0,00823
Bảng 3.2: Các thơng số và kết quả của quá trình phân tích các trình tự và mơ hình tiến hĩa (best-fit-model) giữa chim yến Việt Nam với chim yến của thế giới.
Thơng số Cyt b mtDNA
Tổng số trình tự
Tổng số Nucleotide dĩng hàng Vị trí khơng đổi
Vị trí khơng mang thơng tin Vị trí mang thơng tin
Mơ hình tiến hĩa Tần suất cân bằng Nucleotide
(A, C, G, T) 87 567 525 5 37 GTR (+G+I) 0,2620, 0,4001, 0,1085, 0,2293 c. Đa dạng quần thể chim yến Aerodramus fuciphagus:
Quần thể Aerodramus fuciphagus tại các vùng địa lý ở Việt Nam cho thấy đa
dạng di truyền ở mức độ thấp (12 haplotype/75 cá thể) với sự khác biệt trình tự tại mỗi khu vực dao động từ 0,2091 đến 1,1326%. Cụ thể nhƣ sau:
Bảng 3.3: Giá trị khác biệt trung bình (%) của các mẫu yến tại các khu vực địa lý khác nhau. STT Khu vực Số mẫu Chiều dài trình tự % khác biệt trung bình giữa các cặp trình tự Số nucleotide khác biệt tƣơng đƣơng 1 Khánh Hịa Yến đảo 13
691 0,2091% 1,44 Yến nhà 16 1,1326% 7,83 2 Trảng Bom – Đồng Nai 17 0,6063% 4,19 3 Kiên Giang 17 0,8% 5,53 4 Cơn Đảo 12 0,3411% 2,36
Tuy nhiên, vẫn cĩ một số mẫu cĩ trình tự giống nhau lên đến 100%, đặc biệt là ở khu vực Kiên Giang (2 haplotype/17 cá thể) cĩ rất nhiều cá thể cĩ trình tự giống nhau. Qua kết quả trên cũng cho thấy sự đa dạng haplotype ở mức độ phân lồi của quần thể Aerodramus fuciphagus trên chỉ thị phân tử Cytb ở Việt Nam khá thấp. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu đã cơng bố của Aowphol (2008) trên quần thể chim yến ở Thái Lan.
Hình 3.6: Mạng lƣới haplotype của các phân lồi chim yến (màu sắc mơ tả theo các vùng địa lý). Kích thƣớc các haplotype (hình trịn) tỉ lệ thuận với số lƣợng cá thể bên trong. Vị trí các số liệu màu đỏ tƣợng trƣng cho các sự kiện
3.1.7. Thảo luận
a. Về kết quả cây phát sinh lồi:
Khi khơng sử dụng các trình tự tải về từ GenBank cũng nhƣ nhĩm ngoại, cây phát sinh lồi cho kết quả khá rõ ràng về sự phân tách nhĩm của các mẫu yến theo các khu vực (hình 3.4). Sự xuất hiện của các mẫu yến nhà Khánh Hịa trong các nhánh cĩ hầu hết là yến từ khu vực Trảng Bom – Đồng Nai cĩ thể do nhiều nguyên nhân khác nhau:
- Do tập tính của lồi chim yến, chúng thƣờng bay xa kiếm mồi nên khi gặp điều kiện thuận lợi (các khu vực nuơi yến nhà tại Trảng Bom) chúng sẽ sinh sống tại đĩ. Mặc dù theo một số tài liệu nghiên cứu, lồi yến khá trung thành với vùng lãnh thổ sinh sống, chúng hiếm khi thay đổi chỗ ở (Nguyễn Quang Phách, 1993).
- Do quá trình nuơi yến tại các nhà nuơi, ngƣời dân sử dụng trứng yến thu từ các khu vực khác nhau, cho ấp nở tại chỗ. Khi các chim non lớn lên, chúng đã quen với khu vực sinh sống này nên chúng sẽ tiếp tục sinh sống tại đây.
Nhĩm yến Khánh Hịa và Cơn Đảo phân tách với các nhĩm yến Trảng Bom – Đồng Nai, Kiên Giang. Đặc biệt là yến đảo Khánh Hịa và Cơn Đảo, thậm chí các mẫu yến này khơng hiện diện trong haplotype tổ tiên (haplotype 04). Các mẫu yến Cơn Đảo hình thành 2 nhĩm, nhĩm thứ nhất phân tách với nhĩm yến Khánh Hịa, nhĩm thứ 2 nằm cùng một nhĩm với nhĩm yến đảo Khánh Hịa. Điều này cũng cĩ thể đƣợc giải thích tƣơng tự nhƣ đối với khu vực Trảng Bom bên trên.
Khi sử dụng thêm các trình tự tải về từ GenBank và nhĩm ngoại, cây phát sinh lồi cĩ sự thay đổi vị trí của các nhĩm, tuy nhiên về thành phần nhĩm thì khơng thay đổi (hình 3.5). Nhĩm yến Trảng Bom – Đồng Nai và Kiên Giang nếu nhƣ ở hình 3.4 đƣợc xếp gần với nhĩm yến tổ tiên (tƣơng đƣơng với haplotype 04), thì trong hình này
lại đƣợc xếp gần hơn với nhĩm yến Khánh Hịa. Tuy nhiên vì giá trị BT khơng cao (65/44/52), vị trí nhĩm do đĩ chƣa đƣợc xem là rõ ràng. Ngồi ra việc trình tự bị thu ngắn từ 691bp về 567bp khi giĩng hàng với các trình tự từ GenBank cũng cĩ thể là nguyên nhân gây ra sự thay đổi này.
Nhƣ vậy, kết quả từ nghiên cứu cho thấy lồi chim yến tại khu vực Khánh Hịa và Cơn Đảo tách riêng ra thành một nhĩm khác với yến Trảng Bom – Đồng Nai, Kiên Giang và các trình tự chim yến lấy từ GenBank thuộc 3 phân lồi A. f. germani, A. f. vestitus và A. f. amechanus. Dựa trên các dữ liệu di truyền, cĩ khả năng đây là một
phân lồi mới. Số lƣợng mẫu khu vực Cơn Đảo trong nghiên cứu này cịn ít (12 mẫu – 3 haplotype) những cũng cho thấy sự phân tách với yến nhà ở Trảng Bom và Kiên Giang, cũng nhƣ các phân lồi yến tại Indonesia và Malaysia.
Đồng thời, theo hình 3.5 cĩ thể thấy mẫu chim yến tại Trảng Bom – Đồng Nai cĩ khả năng là phân lồi A. f. vestitus, mẫu chim yến tại Kiên Giang cĩ khả năng là
phân lồi A. f. amechanus. Xét về gĩc độ địa lí, yến nhà ở Kiên Giang cĩ thể do phân
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});