a. Tách chiết DNA tổng số:
Đối với mẫu mơ cơ: DNA đƣợc tách chiết từ mẫu cơ của từng cá thể chim yến con (thu mẫu trực tiếp từ cơng nhân của cơng ty Yến Sào Khánh Hịa, giữ mẫu trong đá băng, sau đĩ đƣợc bảo quản ở -70o
C) bằng dung dịch Chelex 10%. Tiếp theo, dùng panh và kéo vơ trùng cắt một mẩu nhỏ khoảng 0,2cm2 mẫu mơ cơ rồi cho vào 300μl dung dịch Chelex 10%. Tồn bộ mẫu phải nằm trong lớp chứa Chelex. Sau đĩ ủ mẫu trên bể ủ nhiệt ở 95oC trong 5 – 6 giờ. Lấy ra vortex kĩ hỗn hợp trong 30 giây, rồi ly tâm lạnh 5000 vịng/phút trong 5 phút. Sau cùng hút dịch nổi huyền phù sang ống eppendorf mới, DNA thu đƣợc sẽ đƣợc bảo quản trong tủ đơng -40oC.
Đối với mẫu lơng: DNA tổng số đƣợc tách chiết từ phần cuống lơng, mơ cơ thịt của từng cá thể chim yến bằng bộ kit Magazorb® DNA Mini-Prep Kit theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất nhƣ sau:
- Lấy từ 1 – 2 mẫu lơng chim yến (phần gốc) cho vào ống eppendorf 1,5ml đã khử trùng. Dùng kéo nhọn cắt thật nhỏ các lơng chim và đẩy dồn phần mẫu xuống đáy của ống để tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình thủy phân sau này. Sau đĩ thêm 20μl dung dịch protein K vào. Đem vortex trong 15 giây. Tiếp đến hút 200μl Lysis Buffer cho vào ống tube. Vortex nhẹ đến khi hỗn hợp dung dịch mẫu, protein K và Lysis Buffer đồng nhất (khoảng 15 giây). Ủ ống mẫu trên block nhiệt trong 16 đến 24 giờ ở 56oC.
- Thêm 500μl dung dịch Binding Buffer đã đƣợc vortex nhẹ cho vào ống mẫu. Vortex nhẹ hỗn hợp cho đến khi thu đƣợc dịch đồng nhất (khoảng 15 giây). Thêm 20μl dung dịch MagaZorbTM trực tiếp vào dung dịch, vortex nhẹ trong 15 giây. Ủ ở nhiệt độ phịng trong 10 phút, vừa ủ vừa lật úp tube đảm bảo dung dịch đƣợc trộn đều. Làm lắng các hạt MagaZorbTM bằng cách sử dụng một giá từ (giá cĩ gắn nam châm), khoảng 4 – 5 phút. Lúc này các hạt MagaZorbTM đã
liên kết với DNA trong mẫu và cố định chúng lại. Sau đĩ đảo ngƣợc nam châm 2 – 3 lần để rửa sạch nắp ống. Hút bỏ hết phần chất lỏng.
- Thêm 1ml dung dịch đệm rửa vào tube. Sau đĩ lật ngƣợc tube vài lần cho các hạt phân tán hồn tồn. Tiếp tục làm lắng các hạt MagaZorbTM trên giá từ tƣơng tự nhƣ bƣớc trên. Loại bỏ phần chất lỏng. Lặp lại bƣớc rửa 1 – 2 lần nữa cho đến khi phần chất lỏng hồn tồn trong suốt. Sau đĩ ly tâm khơ, để loại bỏ hồn tồn dịch lỏng.
- Thêm 100μl dung dịch đệm rửa giải vào tube. Ủ tube trong 10 phút ở nhiệt độ phịng, vừa ủ vừa lật ngƣợc tube vài lần. Làm lắng các hạt MagaZorbTM trên giá từ. Cẩn thận hút dịch nổi, tránh hút các hạt sang tube sạch mới. Tube mới sẽ chứa DNA đã đƣợc tách chiết, thu đƣợc khoảng 100μl, sau đĩ bảo quản ở -20oC cho các phân tích tiếp theo.