Sau khi nhận đƣợc kết quả giải trình tự từ cơng ty, các trình tự thơ đƣợc tiến hành xử lý bằng các phần mềm chuyên dụng.
Việc xử lý trình tự bao gồm các thao tác nhƣ tạo contig, loại bỏ mồi, đọc sắc ký đồ (chromatography) để điền vào vị trí cịn trống trong trình tự theo nguyên tắc bổ sung sau khi nhận kết quả giải trình tự, sửa các trình tự đọc bị lỗi đƣợc thực hiện trên phần mềm Sequencher v.4.1.4 (Tippmann, 2004). Trình tự sau đĩ đƣợc giĩng hàng và cắt bỏ một số vị trí để đƣợc chiều dài chung bằng nhau bằng phần mềm MEGA5 v.5.2 (Tamura và cs., 2011). Trình tự sau khi đƣợc xử lý sẽ đƣợc nhập vào chƣơng trình BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) để tìm kiếm các trình tự tƣơng đồng (Zhang và cs., 2000).
a. So sánh trình tự gen của chim yến:
Sự khác biệt di truyền giữa các cặp trình tự của các trình tự cần so sánh đƣợc tính tốn theo cơng thức:
Việc so sánh sự khác nhau của các cá thể chim yến đƣợc thực hiện bằng phần mềm BioEdit v.7.2.0 (Hall, 1999). Vì lý do tổng số lƣợng mẫu quá lớn nên việc so sánh sự khác nhau trong trình tự gen của các cá thể giữa các khu vực khác nhau khơng thể thực hiện đƣợc.
b. Phân tích sự đa dạng di truyền (Genetic diversity) của chim yến dựa trên haplotype:
Đa dạng di truyền (Genetic diversity) giữa các quần thể đƣợc tính bằng tổng số haplotype (k), số lƣợng của vị trí đa hình – polymorphic sites (S), đa dạng haplotype –
haplotype diversity (Hd) và đa dạng nucleotide – nucleotide diversity (π), số đột biến (η), sử dụng phần mềm DnaSP v.5.10 (Rozas và cs., 2003).
c. Phân tích mối quan hệ phát sinh lồi (Phylogenetic analysis):
Các phân tích đƣợc thực hiện dựa trên tập hợp các trình tự gen Cyb mtDNA của chim yến. Trong 75 trình tự từ nghiên cứu hiện tại bao gồm 29 mẫu đại diện cho yến Khánh Hịa (bao gồm cả yến đảo và yến nhà), 17 mẫu đại diện cho khu vực Trảng Bom – Đồng Nai, 17 mẫu đại diện cho khu vực Kiên Giang, 12 mẫu đại diện cho khu vực Cơn Đảo. Các trình tự đƣợc lấy từ GenBank của một số phân lồi yến trên thế giới nhƣ sau: A. f. vestitus (Indonesia, 03 mẫu), A. f. germani (Malaysia, 03 mẫu), A. f. amechanus (Malaysia, 03 mẫu). Trình tự của lồi yến A. terraereginae đƣợc sử dụng
làm nhĩm ngoại (Lee và cs., 1996). Thơng tin chi tiết về các trình tự đƣợc sử dụng trong nghiên cứu đƣợc thể hiện rõ ở bảng 2.1:
Bảng 2.1: Thơng tin về các mẫu yến cùng khu vực lấy mẫu đƣợc sử dụng trong nghiên cứu.
Trình tự Tổng số
lƣợng
Khu vực thu mẫu
Mã số gen Nguồn tham
khảo Y01A2, Y02A2, Y05A2, Y06A2, Y07A2, Y08A2, Y09A2, Y10A2, Y11A2, Y12A2, Y01A6, Y02A6, Y03A6 13 Đảo A2, A6 Khánh Hịa
Nghiên cứu hiện tại Y01TB, Y02TB, Y03TB, Y04TB, Y05TB, Y06TB, Y07TB, Y08TB, Y09TB, Y10TB, Y11TB, Y12TB, Y14TB, Y15TB, Y16TB, Y18TB, Y19TB, 17 Trảng Bom – Đồng Nai
Nghiên cứu hiện tại
Y02KG, Y04KG,
Y07KG, Y08KG, 17 Kiên Giang
Nghiên cứu hiện tại
Y09KG, Y10KG, Y11KG, Y12KG, Y13KG, Y14KG, Y16KG, Y17KG, Y18KG, Y20KG, Y21KG, Y22KG, Y23KG Y01TN, Y02TN, Y03TN, Y04TN, Y05TN, Y07TN, Y08TN, Y09TN, Y10TN, Y11TN, Y12TN, Y13TN, Y14TN,Y15TN, Y16TN, Y17TN 16 155 Thống Nhất, Nha Trang, Khánh Hịa
Nghiên cứu hiện tại Y01CD, Y04CD, Y12CD, Y14CD, Y16CD, Y17CD, Y20CD, Y21CD, Y22CD, Y27CD, Y32CD, Y33CD
12 Cơn Đảo Nghiên cứu hiện
tại
A. fuciphagus
amechanus 01 Malaysia EU594262.1
Abdul Rahman và cs (2008)*
A. fuciphagus
amechanus 01 Malaysia EU594263.1
Abdul Rahman và cs (2008)*
A. fuciphagus
amechanus 01 Malaysia EU594264.1
Abdul Rahman và cs (2008)*
A. fuciphagus germani
01 Malaysia EU594265.1 Abdul Rahman
và cs (2008)*
A. fuciphagus germani
01 Malaysia EU594266.1 Abdul Rahman
và cs (2008)*
A. fuciphagus germani
01 Malaysia EU594267.1 Abdul Rahman
và cs (2008)*
A. fuciphagus vestitus
01 Indonesia EU594268.1 Abdul Rahman
và cs (2008)*
A. fuciphagus vestitus
01 Indonesia EU594269.1 Abdul Rahman
và cs (2008)*
A. fuciphagus vestitus
01 Indonesia EU594270.1 Abdul Rahman
và cs (2008)*
A. fuciphagus
terraereginae 01 AY294451.1
Price và cs (2004)*
terraereginae (2004)* A. fuciphagus terraereginae 01 AY294453.1 Price và cs (2004)* Tổng cộng 87 mẫu
*: Đƣợc lấy từ cơ sở dữ liệu của GenBank.
Phân tích mối quan hệ lồi bằng cây tiến hĩa và đa dạng di truyền chim yến đƣợc tiến hành dựa trên 3 thuật tốn: Maximum Parsimony (MP), Maximum Likelihood (ML) và Neighbor-Joining (NJ). Phần mềm MEGA5 v.5.2 (Tamura và cs., 2011) đƣợc sử dụng khi tiến hành xây dựng cây phát sinh lồi trong quần thể ở Nha Trang – Khánh Hịa, với cả 3 thuật tốn MP, ML và NJ. Phân tích cây phát sinh lồi của lồi chim yến từ Việt Nam với các lồi khác trên thế giới bằng cách sử dụng các thuật tốn MP, NJ và ML. Đối với thuật tốn MP và ML, 1000 độ lặp lại ngẫu nhiên đƣợc áp dụng. Trƣớc khi tiến hành thuật tốn ML các mơ hình tiến hĩa đƣợc kiểm tra bằng phần mềm MEGA5 v.5.2 (Tamura và cs., 2011). Các thơng số của quá trình phân tích các trình tự và mơ hình tiến hĩa (best-fit-model) của phân tích di truyền quần thể
Aerodramus fuciphagus cũng đƣợc kiểm tra bởi phần mềm MEGA5 v.5.2 (Tamura và
cs., 2011). Giá trị Boostrap (BT) đƣợc tính tốn để xác định tính chính xác của thuật tốn MP với độ lặp lại 1000. Do số lƣợng trình tự quá lớn, phƣơng pháp successive approximation approach đƣợc áp dụng đối với thuật tốn ML (Sullivan và cs., 2005). Xác định cây phát sinh lồi dựa trên mơ hình tiến hĩa, so sánh kết quả thu đƣợc với phƣơng pháp phân tích MP. Cây phát sinh lồi đƣợc biểu hiện và hiệu chỉnh bằng phần mềm MEGA5 v.5.2 (Tamura và cs., 2011).