2.3.1. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1.1. Phương pháp phân tích các chỉ tiêu
ạ Xác định hàm lượng cacbonhydrat trong rong biển theo (AOAC 986.25) Cacbonhydrat (%) = Tổng hàm lượng chất khô – (lipit + protein + tro)
Phân tích hàm lượng tro theo (AOAC 938.08)
Nguyên tắc chung: Tro hoá mẫu bằng nhiệt. Sau đó xác định hàm lượng tro bằng phương pháp khối lượng và xác định độ kiềm của tro bằng phương pháp chuẩn độ.
Phân tích độ ẩm theo TCVN 3700-90
Nguyên tắc chung: Dùng nhiệt để loại bỏ nước khỏi mẫu thử. Hiệu số khối lượng của mẫu thử trước và sau khi sấy khô là lượng ẩm có trong mẫụ
Phân tích hàm lưọng chất béo thô theo TCVN 3703-2009
Nguyên tắc chung: Dùng dung môi hữu cơ chiết rút mỡ của mẫu thử trong máy soclet. Sấy và cân lượng mỡ đã được chiết rút.
Phân tích hàm lượng protein thô theo TCVN 3705-90
Nguyên tắc chung: Vô cơ hóa mẫu thử bằng axit sunfuric đậm đặc, nitơ có trong mẫu thử chuyển thành amon sunfat. Dùng kiềm đặc đẩy amoniac ra khỏi amon sunfat trong máy cất đạm, tạo thành amon hydroxyt, rồi định lượng bằng axit. b. Phương pháp xác định thành phần các loại đường bằng sắc ký trao đổi ion hiệu năng cao trên máy GC-FID Agilent (Mỹ) HP3ICS-3000, cột phân cực nhẹ, SP 17 A, đầu dò PID.
2.3.1.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm
Bố trí thí nghiệm xác định hàm lượng cacbonhydrat trong rong nâu
Sargassum polycystum theo phương pháp cổ điển.
Bố trí thí nghiệm xác lập các điều kiện thủy phân tối ưu bằng một số loại acid theo phương pháp cổ điển.
Bố trí thí nghiệm xác lập các điều kiện lên men ethanol tối ưu từ dịch thủy phân theo phương pháp cổ điển.
2.3.2. Phương pháp xử lý số liệu
Xử lý số liệu nghiên cứu theo phương pháp thống kê, mỗi thí nghiệm làm 3 lần. Kết quả là trung bình cộng của các lần thí nghiệm, xử lý số liệu bằng phần mềm Microsoft Excel 2007, SPSS 16.0.
2.4. Bố trí thí nghiệm
2.4.1. Bố trí thí nghiệm tổng quát 2.4.1.1. Quy trình nghiên cứu dự kiến 2.4.1.1. Quy trình nghiên cứu dự kiến
Hình 2.3. Sơ đồ quy trình dự kiến thu nhận ethanol sinh học từ dịch rong nâu thủy phân bằng acid.
Nhiệt độ thường Rong nâu
khô
Bổ sung nước
Nhiệt độ thủy phân Nồng độ acid Trung hòa Thủy phân bằng acid Lọc Dịch thủy phân Ethanol Loại acid
Thời gian thủy phân Xử lý, xay nhỏ
Lên men
Chưng cất
pH môi trường Tỷ lệ nấm men
Thời gian lên men Bã
2.4.1.2. Thuyết minh sơ đồ quy trình (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nguyên liệu
Thu nhận rong nâu sau khi được phơi khô, nếu không sử dụng ngay phải bảo quản rong nâu khô trong điều kiện tốt nhất để tránh ảnh hưởng đến chất lượng của sản phẩm sau nàỵ Chất lượng nguyên liệu là yếu tố ảnh hưởng lớn đến chất lượng sản phẩm sau nàỵ
Xử lý, xay nhỏ
Xử lý nhằm mục đích loại những tạp chất thô không mong muốn trong nguyên liệụ Dùng tay để phân loại, loại những loài rong không phải rong Nâu, loại cát, sạn và san hô còn bám trên rong.
Tiến hành cắt và xay nhỏ để thuận lợi cho công đoạn thủy phân tiếp theọ
Bổ sung nước
Nước là nhân tố không thể thiếu trong quá trình thủy phân. Nước tạo môi trường thuận lợi để phản ứng thủy phân diễn ra nhanh chóng và đạt hiệu suất cao nhất. Nước được dùng là nước cất một lần.
Thủy phân
Đây là quá trình chuyển các polysaccharide của rong nâu thành các monosaccharide hòa tan. Quá trình này được thực hiện trong môi trường acid dưới tác dụng của nhiệt độ và áp suất caọ
Cho dung dịch acid vào hỗn hợp nước và rong nâu khô đã được cắt xay nhỏ. Sau đó, tiến hành thủy phân trong thiết bị hấp vô trùng (autoclave) ở nhiệt độ và áp suất caọ
Lọc
Lọc nhằm tạo điều kiện thuận lợi cho việc xác định các chỉ tiêu hóa học và các công đoạn kế tiếp. Sau khi tiến hành thủy phân tiến hành lọc bằng vải và bông lọc, loại bỏ bã rong nâụ
Trung hòa dịch thủy phân
Công đoạn này nhằm mục đích trung hòa lượng dung môi acid đem đi thủy phân, để tạo môi trường thuận lợi cho nấm men hoạt động sau nàỵ
Tiến hành trung hòa dịch thủy phân bằng dung dịch NaOH 20% và NaOH 1% với chất chỉ thị là phenolphtalein 1%.
Lên men
Mục đích của công đoạn này là chuyển hóa các loại đường đơn có trong dịch thủy phân rong nâu thành ethanol sinh học.
Tiến hành lên men với pH môi trường, tỷ lệ nấm men và thời gian lên men thích hợp. Lên men ở nhiệt độ phòng.
Chưng cất
Sau khi lên men, tiến hành chưng cất để thu lượng ethanol được tạo thành. Chưng cất bằng thiết bị cô quay chân không ở nhiệt độ 500C, áp suất <100 mbar và thời gian chưng cất là 1 h.
Ethanol
Dung dịch ethanol sau khi chưng cất sẽ được bảo quản trong các lọ thủy tinh có nắp đậy kín ở nhiệt độ phòng.
2.4.2. Bố trí thí nghiệm chi tiết
2.4.2.1. Bố trí thí nghiệm xác định chế độ thủy phân cacbonhydrat trong rong nâu Sargassum polycystum nâu Sargassum polycystum
ạ Bố trí thí nghiệm lựa chọn loại acid thủy phân cacbonhydrat trong rong nâu
Sargassum polycystum thích hợp
Mục đích
Theo một số tài liệu cho thấy, acid ascorbic và acid sunfuric có khả năng thủy phân cacbonhydrat trong rong nâu để tạo ra các đường có khả năng lên men ethanol. Vì vậy tôi tiến hành thí nghiệm với 2 acid: acid sunfuric và acid ascorbic.
Cách tiến hành
Chuẩn bị 3 mẫu thí nghiệm. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Thủy phân ở cùng điều kiện - Khối lượng mẫu: 5g.
- Nhiệt độ thủy phân: 1100C. - Thời gian thủy phân: 100 phút.
Mỗi mẫu cân 5g rong nâu khô đã được xử lý, xay nhỏ. Cho vào bình tam giác 250ml. Sau đó cho thêm 100ml nước cất. Tiến hành bọc kín bình, đem thủy phân ở nhiệt độ 1100C , thời gian 100 phút với các mẫu như sau: mẫu 1 (không bổ sung acid), mẫu 2 ( bổ sung 1% acid sunfuric), mẫu 3 (bổ sung 1% acid ascorbic). Tiếp đó lọc loại bã và xác định hàm lượng đường khử của các mẫu dịch lọc. Từ đó lựa chọn acid thích hợp cho thủy phân rong nâụ
Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định loại acid thủy phân thích hợp.
Rong nâu khô
Phân loại, xay nhỏ (m=5g)
Bổ sung nước(V=100ml)
Thủy phân
(t0=1100C, T=100 phút)
Lọc
Kiểm tra lượng đường khử
Acid sunfuric 1% Không có acid Acid ascorbic 1%
b. Bố trí thí nghiệm xác định nồng độ acid thủy phân cacbonhydrat trong rong nâu Sargassum polycystum
Mục đích
Sau khi lựa chọn được loại acid thủy phân cacbonhydrat trong rong nâu
Sargassum polycystum thích hợp, tôi tiến hành thí nghiệm xác định nồng độ acid thủy phân. Xác định được nồng độ acid nhằm nâng cao hiệu suất thủy phân và tiết kiệm hóa chất cũng như chi phí thực hiện.
Cách tiến hành
Chuẩn bị 7 mẫu thí nghiệm.
Thủy phân ở cùng điều kiện: - Khối lượng mẫu: 5g.
- Nước cất bổ sung: 100 ml. - Nhiệt độ thủy phân: 1100C. - Thời gian thủy phân: 100 phút.
- Loại acid: kết quả thí nghiệm mục 2.4.2.1_ạ
Mỗi mẫu cân 5g rong nâu khô đã được xử lý, xay nhỏ. Cho vào bình tam giác 250ml. Sau đó cho thêm 100ml nước cất. Sau đó bổ sung loại acid đã được xác định ở thí nghiệm mục 2.4.2.1_a với 7 mẫu ở các nồng độ tương ứng: 0.5%; 1%; 2%; 3%; 4%; 5%; 6%. Tiến hành bọc kín bình, đem thủy phân ở nhiệt độ 1100C, thời gian 100 phút. Tiếp đó lọc loại bã và xác định hàm lượng đường khử của các mẫu dịch lọc. Từ đó lựa chọn nồng độ acid thích hợp cho quá trình thủy phân cacbonhydrat rong nâu Sargassum polycystum.
Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nồng độ acid thủy phân thích hợp.
Lọc
Kiểm tra lượng đường khử Chọn nồng độ acid thích hợp Thủy phân (t0=1100C, T=100 phút) 1% 2% 3% 4% 5% 0.5% 6%
Rong nâu khô
Phân loại, xay nhỏ (m=5g)
Bổ sung nước(V=100ml) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
c. Bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ thủy phân cacbonhydrat trong rong nâu
Sargassum polycystum
Mục đích
Sau khi lựa chọn được loại acid, nồng độ acid thủy phân cacbonhydrat trong rong nâu Sargassum polycystum thích hợp, tôi tiến hành thí nghiệm xác định nhiệt độ thủy phân. Xác định được nhiệt độ tối ưu để quá trình thủy phân diễn ra với hiệu suất cao nhất, giảm hao mòn thiết bị, an toàn trong sản xuất đồng thời tiết kiệm chi phí nhất.
Cách tiến hành
Chuẩn bị 5 mẫu thí nghiệm.
Thủy phân ở cùng điều kiện: - Khối lượng mẫu: 5g.
- Nước cất bổ sung: 100ml.
- Loại acid: kết quả thí nghiệm mục 2.4.2.1_ạ - Nồng độ acid: kết quả thí nghiệm 2.4.2.1_b. - Thời gian thủy phân: 100 phút.
Mỗi mẫu cân 5g rong nâu khô đã được xử lý, xay nhỏ. Cho vào bình tam giác 250ml. Sau đó cho thêm 100ml nước cất. Sau đó bổ sung loại acid đã xác định ở thí nghiệm mục 2.4.2.1_a với nồng độ thích hợp đã xác định ở thí nghiệm 2.4.2.1_b. Tiến hành bọc kín bình, đem thủy phân trong thời gian 100 phút, với 5 mẫu ở các khoảng nhiệt độ tương ứng: 1000C; 1050C; 1100C; 1150C; 1200C và 1250C. Tiếp đó lọc loại bã và xác định hàm lượng đường khử của các mẫu dịch lọc. Từ đó lựa chọn nhiệt độ thích hợp cho quá trình thủy phân cacbonhydrat trong rong nâu Sargassum polycystum bằng acid.
Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ thủy phân thích hợp.
Thủy phân (T=100 phút)
1000C 1050
C 1100C 1150C 1200C 1250C
Lọc
Kiểm tra lượng đường khử
Chọn nhiệt độ thủy phân thích hợp
Rong nâu khô
Phân loại, xay nhỏ (m=5g)
Bổ sung nước(V=100ml)
d. Bố trí thí nghiệm xác định thời gian thủy phân cacbonhydrat trong rong nâu
Sargassum polycystum
Mục đích
Sau khi lựa chọn được loại acid, nồng độ acid và nhiệt độ thủy phân phù hợp nhất, tôi tiến hành bố trí thí nghiệm lựa chọn thời gian thủy phân. Thời gian thủy phân ảnh hưởng rất lớn đến hiệu suất thủy phân và của ethanol. Nếu thời gian thủy phân ngắn thì không cắt mạch được hết các liên kết glucozit của các hợp chất cacbonhydrat trong nguyên liệu, nhưng nếu thời gian thủy phân quá dài, dịch thủy phân sẽ bị lẫn nhiều tạp, gây bất lợi cho các công đoạn saụ Vì vậy cần phải bố trí nghiệm xác định thời gian thủy phân phù hợp nhất để nâng cao hiệu suất thủy phân và tiết kiệm chi phí nhất.
Cách tiến hành
Chuẩn bị 5 mẫu thí nghiệm.
Thủy phân ở cùng điều kiện: - Khối lượng mẫu: 5g.
- Nước cất bổ sung: 100ml.
- Loại acid: kết quả thí nghiệm mục 2.4.2.1_ạ - Nồng độ acid: kết quả thí nghiệm 2.4.2.1_b. - Nhiệt độ thủy phân: kết quả thí nghiệm 2.4.2.1_c. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Mỗi mẫu cân 5g rong nâu khô đã được xử lý, xay nhỏ. Cho vào bình tam giác 250ml. Sau đó cho thêm 100ml nước cất. Sau đó bổ sung loại acid đã xác định ở thí nghiệm mục 2.4.2.1_a với nồng độ thích hợp đã xác định ở thí nghiệm 2.4.2.1_b. Tiến hành bọc kín bình, đem thủy phân ở nhiệt độ đã xác định được ở thí nghiệm 2.4.2.1_c, với 5 mẫu ở các khoảng thời gian tương ứng: 60 phút; 90 phút; 120 phút; 150 phút và 180 phút. Tiếp đó lọc loại bã và xác định hàm lượng đường khử của các mẫu dịch lọc. Từ đó lựa chọn thời gian thích hợp cho quá trình thủy phân cacbonhydrat trong rong nâu Sargassum polycystum bằng acid.
Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Hình 2.7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian thủy phân thích hợp.
Thủy phân
60 phút 90 phút 120 phút 150 phút 180 phút
Lọc
Kiểm tra lượng đường khử
Chọn thời gian thủy phân thích hợp
Rong nâu khô
Phân loại, xay nhỏ (m=5g)
Bổ sung nước(V=100ml)
2.4.2.2. Bố trí thí nghiệm sản xuất thử nghiệm ethanol sinh học từ dịch rong nâu thủy phân nâu thủy phân
ạ Bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ nấm men sử dụng
Mục đích
Xác định được tỷ lệ nấm men Saccharomyces cerevisiae bổ sung vào dịch thủy phân để quá trình lên men diễn ra đạt hiệu quả và tiết kiệm chi phí nhất.
Cách tiến hành
Chuẩn bị 6 mẫu thí nghiệm.
Lên men ở cùng điều kiện: - Khối lượng mẫu: 5 g - pH môi trường: 5
- Nhiệt độ lên men: nhiệt độ phòng - Thời gian lên men: 3 ngày
Cân 5 g rong nâu khô đã được xử lý, xay nhỏ. Cho vào bình tam giác 250ml. Sau đó cho thêm 100ml nước cất. Sử dụng kết quả của các thí nghiệm xác định chế độ thủy phân để thu được dịch thủy phân. Tiếp đó lọc loại bã và trung hòa lượng acid trong dịch bằng dung dịch NaOH 20% với chỉ thị là dung dịch phenolphtalein 1%. Rồi điều chỉnh pH môi trường bằng dung dịch đệm CH3COOH/CH3COONa có pH=5. Tiếp theo, bổ sung nấm men với tỷ lệ tương ứng là 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%. Đem mẫu lên men ở nhiệt độ phòng với thời gian lên men là 3 ngàỵ Chú ý phải khuấy đảo dịch lên men trong 24h đầụ Sau đó đem mẫu đi chưng cất ethanol bằng thiết bị cô quay chân không với số vòng quay 30 vòng/phút, nhiệt độ 500C, áp suất <100 mbar và thời gian cô quay là 60 phút. Tiến hành xác định thể tích dịch thu hồi, xác định hàm lượng đường khử còn sót. Sau khi có kết quả đánh giá, lựa chọn mẫu cho hàm lượng đường còn lại thấp nhất.
Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Hình 2.8. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ nấm men bổ sung thích hợp.
Chưng cất Điều chỉnh pH
Kiểm tra lượng đường còn lại Lên men Bổ sung nấm men 0.5% 1% 1.5% 2% 2.5% 3% Xác định tỷ lệ nấm men thích hợp
Rong nâu khô Phân loại, xay nhỏ
(m=5 g)
Bổ sung nước (V=100 ml) Bổ sung acid
Thủy phân
Trung hòa dịch thủy phân
b. Bố trí thí nghiệm xác định pH môi trường lên men thích hợp (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Mục đích
Điều chỉnh pH môi trường nhằm tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển tăng sinh khối của nấm men, để quá trình lên men đạt hiệu quả tốt nhất.
Cách tiến hành
Chuẩn bị 4 mẫu thí nghiệm.
Lên men ở cùng điều kiện: - Khối lượng mẫu: 5 g.
- Tỷ lệ nấm men: kết quả thí nghiệm mục 2.4.2.2_ạ - Nhiệt độ lên men: nhiệt độ phòng.
- Thời gian lên men: 3 ngàỵ
Cân 5 g rong nâu khô đã được xử lý, xay nhỏ. Cho vào bình tam giác 250ml. Sau đó cho thêm 100 ml nước cất. Sử dụng kết quả của các thí nghiệm xác định chế độ thủy phân để thu được dịch thủy phân. Tiếp đó lọc loại bã và trung hòa lượng acid trong dịch bằng dung dịch NaOH 20% với chỉ thị là dung dịch phenolphtalein 1%. Rồi điều chỉnh pH môi trường bằng dung dịch đệm CH3COOH/CH3COONa có pH tương ứng là 4; 4.5; 5; 5.5. Tiếp theo, bổ sung nấm men với tỷ lệ tương ứng kết quả thí nghiệm mục 2.4.2.2_ạ Đem mẫu lên men ở nhiệt độ phòng với thời gian lên men là 3 ngàỵ Chú ý phải khuấy đảo dịch lên men trong 24h đầụ Sau khi lên men đủ thời gian, đem mẫu đi chưng cất ethanol bằng thiết bị cô quay chân không với số vòng quay 30 vòng/phút, nhiệt độ 500C, áp suất <100 mbar và thời gian cô quay là 60 phút. Tiến hành xác định thể tích dịch thu hồi, xác định hàm lượng đường khử còn lạị Sau khi có kết quả đánh giá, lựa chọn mẫu cho hàm lượng đường còn lại thấp nhất.
Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Hình 2.9. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định pH môi trường lên men thích hợp.
4 4.5 5 5.5
Rong nâu khô Phân loại, xay nhỏ
(m=5 g)
Bổ sung nước (V=100 ml) Bổ sung acid
Thủy phân
Trung hòa dịch thủy phân
Lọc
Điều chỉnh pH
Bổ sung nấm men
Chưng cất
Kiểm tra lượng đường còn lại
Lên men
Chọn pH lên men thích hợp
c. Bố trí thí nghiệm xác định thời gian lên men
Mục đích
Việc bố trí thí nghiệm xác định thời gian lên men thích hợp nhằm để tận thu được lượng sinh khối nấm men cao nhất, đồng thời cũng nhằm tiết kiệm thời gian và chi phí lên men.