Tạo vi nang bằng phương pháp đông tụ (coacervation)

1.3.4.1 Bản chất của phương pháp đông tụ

Quá trình đông tụ (coacervation), theo định nghĩa của Speiser (1976), là một quá trình nhằm vận chuyển các đại phân tử có khả năng tạo màng từ trạng thái solvate hóa trong pha trung gian, tức pha đông tụ, sang một pha khác trong đó

những đại phân tử này sẽ tạo thành lớp màng bao quanh mỗi phần tử thuộc pha này, và trong giai đoạn cuối cùng, lớp màng này sẽ được làm cứng lại.

1.3.4.2 Phân loại các phương pháp đông tụ

Hai phương pháp đông tụ thường dùng để tạo vi nang bao gồm:

Quá trình đông tụ đơn giản (simple coacervation) dựa trên phương thức đẩy một polymer ra khỏi pha nước bằng cách bổ sung các chất (ví như muối hay rượu) có ái lực với nước mạnh hơn polymer đó. Quá trình này có bản chất của một quy trình tách nước trong đó quá trình phân tách pha lỏng giúp hình thành nên các phần tử dạng rắn do các giọt dầu được bao trong lớp vỏ polymer và khi lớp vỏ cứng lại sẽ tạo thành các hạt vi nang.

Quá trình đông tụ phức hợp (complex coacervation) lại hình thành nên phức hệ mang điện trái dấu. Quá trình này bao gồm việc phối trộn hai dung dịch keo tại giá trị pH thích hợp sao cho một dung dịch keo tích điện âm, trong khi dung dịch keo còn lại sẽ tích điện dương, việc phối trộn như vậy sẽ dẫn đến hiện tượng tách pha và các phần tử dạng rắn hay các giọt lỏng sẽ được bao trong lớp vỏ hình thành từ hỗn hợp keo trên (Rabiskova và Valaskova, 1998).

Một số thông số như trọng lượng phân tử của polymer, tỷ lệ về khối lượng giữa các polymer sử dụng, nhiệt độ và thời gian tiến hành đều có thể tác động đến quá trình hình thành cũng như mức độ hoàn thiện của giọt đông tụ. Phương pháp đông tụ thích hợp khi vật liệu nhân nang ở thể rắn hoặc lỏng thuộc nhóm chất không tan trong nước, như vậy các hoạt chất sẽ không bị hòa tan vào pha nước. Có thể sử dụng các chất hoạt động bề mặt kỵ nước nhằm tăng hiệu suất bao quanh pha dầu (Rabiskova và Valeskova, 1998)

Các giọt tụ coacervate được hình thành thông qua cơ chế tách pha lỏng-lỏng từ một dung dịch nước thành một pha lỏng giàu polymer (pha đông tụ) và một pha lỏng nghèo polymer. Tùy theo số lượng các dạng polymer hiện diện trong chất lỏng mà quá trình có thể được xếp loại như sau: quá trình đông tụ (đơn giản) khi chỉ có một loại polymer hiện diện, hay là quá trình đông tụ phức hợp khi trong dung dịch

có chứa ít nhất hai loại polymer tích điện trái dấu. Trong đó, dạng giọt tụ phức hợp thường được dùng để tạo vi nang chứa các chất mang hoạt tính.

1.3.4.3 Một số ứng dụng tạo vi nang các hợp chất dạng dầu bằng phương pháp đông tụ đông tụ

Có nhiều nhà nghiên cứu đã thành công về việc tạo vi nang bằng phương pháp đông tụ với hỗn hợp là protein (gelatin ...) và tinh bột (gôm Arabica, Cellulose...). Tuy nhiên hiệu suất bao gói phụ thuộc nhiều vào độ ổn định của hỗn hợp nhũ tương trước và sau khi tiến hành đông tụ. Ví dụ như Rabisco và cs đã bổ sung Span 85, Span 80, Span 40, lecithin từ lòng đỏ, Tween 80 vào trong quá trình bao gói acide oleic (Rabiskova & Valaskova 1998). Zhi-Jian-Dong và cs đã dùng transglutaminase để thay thế formaldehyde hay glutaraldehyde trong quá trình bao gói dầu bạc hà (Dong et al. 2011). Sovilj và cs trong nghiên cứu về tạo vi nang đối với dầu từ hạt hướng dương, từ quả hạt bí đỏ và từ hỗn hợp dầu từ hạt hướng dương và hạt lanh, đã dùng chất hoạt động bề mặt sodium dodecylsulfate (SDS) kết hợp với 1% hydroxypropylmethylcellulose (HPMC)/sodium carboxymethycellulose (NaCMC) tỷ lệ (0.7/0.3). Hiệu quả của việc tạo vi nang sau khi sấy từ 3 loại dầu trên đạt khoảng 5 g dầu/ g vi nang (Sovilj & Petrovic 2006).

Một nghiên cứu khác của Zimit and Livney (2009) đã tạo được các hạt vi nang DHA với kích thước 100 µm với chất bao gói là betalactoglobulin và pectin. Theo nhóm nghiên cứu này thì 0,22 mM DHA được trộn với 0,05% betalactoglobulin, sau đó thêm 0,6% pectin, và chỉnh pH = 4,5. Các hạt vi nang tạo ra bền và trong suốt trong môi trường nước. Tuy nhiên, hàm lượng DHA được bao gói thì tương đối thấp so với các phương pháp khác.

1.4 Tình hình nghiên cứu tạo vi nang dầu gấc ở Việt Nam

Công nghệ vi nang là một lĩnh vực rất được thế giới quan tâm và cũng đã có rất nhiều công bố khoa học về tạo vi nang các hợp chất tan trong dầu (tinh dầu, dầu cá, axit béo không no PUFA ...). Phương pháp phổ biến sử dụng là phương pháp sấy phun và phương pháp đông tụ. Tuy nhiên, vi nang dầu gấc thì hiện nay có rất ít công bố thế giới.

Công bố gần đây nhất là của Kha và cs nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện sấy đối với quá trình sấy màng gấc ở nhiệt độ từ 120⁰C đến 200⁰C với vật liệu trợ sấy là maltodextrin ở các nồng độ khác nhau (10%, 20%, 30%). Hiệu suất tạo vi nang đạt được từ 30 – 80% (Kha et al.2010)

Nghiên cứu của Vương và cs (Vuong et al. 2005), Viện Công nghiệp thực phẩm, thử nghiệm tạo vi nang beta – caroten thu được từ nấm sợi Blakeslea trispora

bằng phương pháp đông tụ với gelatin làm rắn bằng glutaraldehyde và phương pháp bay hơi dung môi sử dụng chitosan. Đối với phương pháp bay hơi dung môi, vi nang tạo thành có màu nâu đậm, hiệu suất tạo vi nang đạt được 27.27%, đồng thời hạt vi nang có kích thước dưới 100 µm. Đối với phương pháp đông tụ, nhóm tác giả đã tạo được hạt vi nang có màu vàng cam, có kích thước dưới 400 µm với hiệu suất tạo vi nang lên tới 80.68%. Tuy nhiên, sản phẩm vi nang tạo thành theo hai phương pháp này không có khả năng hòa tan vào trong nước.

Nghiên cứu của Đặng và cs (Dang et al. 2009), Đại học Dược Hà Nội, nghiên cứu tạo hạt nano dầu gấc với phương pháp khuếch tán nhũ tương và polymer hóa bề mặt. Nghiên cứu này sử dụng polyvinyl alcohol làm vỏ vi nang.

Ngoài ra, các công bố về sản xuất bột gấc mới chỉ quan tâm đến chế độ tách chiết và sấy để bảo quản hoạt tính của dầu gấc chứ chưa quan tâm tới biện pháp bảo vệ các hoạt tính đó (tạo vi nang) (Tran 2007).

CHƯƠNG II: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu dùng nghiên cứu 2.1.1 Nguyên liệu 2.1.1 Nguyên liệu

Dầu gấc Việt Nam G8 của công ty chế biến dầu thực vật và thực phẩm Việt Nam VNPOFOOD.

2.1.2 Hóa chất

Polymer sinh học biển sử dụng trong đề tài gồm gelatin và carrageenan.

Chất nhũ hóa sử dụng là Tween 80 và Span 80

2.1.3 Dụng cụ, trang thiết bị

Dụng cụ Trang thiết bị Pipet 5000 Cân kĩ thuật 1000g

Con cá từ Cân phân tích Cốc thủy tinh Máy khuấy từ Ống đong 100ml Bếp từ

Bình đo tỷ trọng Tủ lạnh

Ống nghiệm Thiết bị đồng hóa Bình định mức Bể ổn nhiệt Ống ly tâm Tủ ấm 37⁰C

Đũa thủy tinh Kính hiển vi: Model Motic BA 300; kính hiển vi 3 mắt ngắm có camera và máy tính.

Nhiệt kế thủy ngân Thiết bị đo độ nhớt hiệu BROOKFIELD dòng Viscometer – DV- I Prime, model LVDV_I, serial AP 6522124.

Phần mềm đo kích thước hạt Motic Images Plus 2.0 MIPlus. Phần mềm chụp ảnh MC Camera

Tủ sấy

Máy đo quang UV

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp

• Đo khối lượng bình trống (m_b) bằng cân phân tích

• Điền nước cất vào bình trống và đo tổng khối lượng bình và nước cất (m_t)

• Tính thể tích của bình (V_g) bằng công thức:

V_g = m_w/ρ_w = (m_t - m_b)/ρ_w

m_t là tổng khối lượng bình và nước cất

m_b là khối lượng bình trống

ρ_w là khối lượng riêng của nước ở các nhiệt độ đo lường cụ thể (Bảng 2.1)

Bảng 2.1 Khối lượng riêng của nước ở áp suất 1atm ở các nhiệt độ khác nhau

• Điền vào bình dung dịch polymer và cân tổng khối lượng (m_c). Tính tỉ trọng của pha liên tục (ρ_c):

ρc = (mc – mb)/Vg

m_c: tổng khối lượng bình và dung dịch polymer

• Lặp lại phép đo với pha phân tán để xác tỉ trọng của nó (ρ_d):

m_d: tổng khối lượng bình và dung dịch pha phân tán

• Lặp lại phép đo với mẫu nhũ tương để xác định tỉ trọng của nó (ρ):

m_e :tổng khối lượng bình và mẫu nhũ tương

• Tính toán phần tỉ lệ pha phân tán (volume fraction – φ):

φ = (ρ – ρ_d)/(ρ_c - ρ_d)

2.2.2 Xác định kích thước các tiểu phân

Mẫu nhũ tương lưu trữ trong ống nghiệm sẽ được lấy ra cho lên lam kính và soi dưới kính hiển vi theo các mốc thời gian nhất định.

Hạt soi dưới kính hiển vi được chụp hình lại và đo kích thước bằng phần mềm Motic Image 2.0.

2.2.3 Xác định độ nhớt – nồng độ polymer

Độ nhớt các polymer và hỗn hợp nhũ tương được xác định bằng máy đo độ nhớt BROOKFIELD dòng Viscometer – DV- I Prime.

Đo độ nhớt của các dung dịch polymer và các mẫu nhũ tương với các nồng độ khác nhau ở nhiệt độ 40⁰C.

2.2.4 Xác định vạch phân pha

Phương pháp

• Cho mẫu nhũ tương vào ống nghiệm

• Dán kín miệng ống nghiệm và để mẫu vào nơi tránh ánh sáng mạnh. Đối với hỗn hợp nhũ tương gelatine thì để trong tủ ấm 37⁰C. Đo chiều cao của tầng phân chia với thước đo vào những khoảng thời gian nhất định.

2.2.5 Xác định hiệu suất bao gói

Phương pháp

Xác định hàm lượng caroten trong dầu gấc:

- Cân chính xác khoảng 0.5 g dầu gấc vào bình định mức 25 mL - Định mức lên 25 mL với hexane.

- Quét phổ với độ pha loãng thích hợp (f) để xác định các đỉnh, đáy hấp thụ. Ghi lại phổ và giá trị các đỉnh, đáy. Ghi lại giá trị A452, 472, 503.

Xác định hàm lượng carotene trong nhũ tương:

- Lấy chính xác 10 mL nhũ tương (dùng bình định mức 10 mL để đong) - Trích ly 3 lần với hexane (dùng phễu chiết), khoảng 5 - 10 mL hexane mỗi lần. - Trộn lẫn 3 lần chiết và định mức lên 25 mL.

- Quét phổ để xác định các đỉnh, đáy hấp thụ. Ghi lại phổ và giá trị các đỉnh, đáy. Ghi lại giá trị A452, 472, 503

Xác định hàm lượng carotene trong hạt ướt/ khô:

- Lấy khoảng 0.5g hạt cho vào cối dùng chày nghiền mịn.

- Cân chính xác khoảng 0.5g hạt đã nghiền mịn vào tube thuỷ tinh có nắp đậy kín để tách chiết.

- Thêm vào tube khoảng 3 mL hexane, lắc đều trong 5 phút, để lắng, thu lấy phần dung dịch phía trên.

- Tiếp tục trích ly với hexane thêm 2 lần tới khi bột không còn màu nữa.

- Trộn lẫn dịch chiết của 3 lần chiết vào bình định mức 10 mL và định mức tới 10 mL với hexane.

- Quét phổ để xác định các đỉnh, đáy hấp thụ. Ghi lại phổ và giá trị các đỉnh, đáy. Ghi lại giá trị A452, 472, 503 (pha loãng tới nồng độ thích hợp đảm bảo các peak hấp thụ có giá trị <1).

Xác định hàm ẩm của hạt thu được bằng phương pháp sấy tới khối lượng không đổi ở 105⁰C.

Công thức xác định hàm lượng carotene

- Hàm lượng carotene trong dầu gấc = BCg (mg/g).

- Hàm lượng carotene trong nhũ tương tính theo lý thuyết: BCemulsion1 = (BCg x Vg x dg) / Vp (mg/mL)

- Hàm lượng carotene trong nhũ tương theo xác định:

BCemulsion2 = (A452 x 10 / 2592) x 25 mL x f / 10 mL (mg/mL) - Hàm lượng carotene trong hạt:

BChạt = (A452 x 10 / 2592) x 10 mL x f / 0.5 g (mg/g) - Hàm ẩm của hạt = W (%)

- Hiệu suất bao gói = (BChạt x M g) / (BCemulsion x (Vp + Vg)) (%). - Hiệu quả bao gói = (M g x W %) / (Vp x Cp + Vg x d) (%).

2.2.6 Xác định sự biến đổi lượng nước của hạt trong quá trình khuấy khi tạo hạt

Phương pháp

- Dùng pipet 5000 để tạo hạt, sau đó khuấy hạt trong các khoảng thời gian khác nhau và tiến hành cân khối lượng của hạt tại các thời gian đó để xác định sự biến đổi lượng nước của hạt trong quá trình sấy ở các dung môi khác nhau.

2.3 Bố trí thí nghiệm 2.3.1 Quy trình dự kiến 2.3.1 Quy trình dự kiến

Sơ đồ quy trình dự kiến:

Sơ đồ 2.1 Sơ đồ quy trình dự kiến tạo vi nang dầu gấc.

Tạo hạt vi nang

Đồng hóa

Khuấy

Polymer (Gelatine và carrageenan)

Khuấy trong nước lạnh

Vớt ra khăn vải thấm nước, làm lạnh hạt

Phơi ở nhiệt độ phòng

Bao gói, bảo quản

Sản

phẩm

Dầu gấc Chất nhũ hóa

2.3.2 Nghiên cứu thăm dò ảnh hưởng của chất nhũ hóa đến độ bền của hệ nhũ tương. tương.

Mục đích của thí nghiệm:

Xác định ảnh hưởng của chất nhũ hóa đến độ bền của nhũ tương và chất lượng sản phẩm.

Chọn được chất nhũ hóa và nồng độ chất nhũ hóa thích hợp nhằm: - Tăng khả năng tạo hạt.

- Giúp hạt tạo thành có chất lượng cao nhất.

Sơ đồ bố trí thí nghiệm

Sơ đồ 2.2 Thí nghiệm thăm dò ảnh hưởng của chất nhũ hóa đến độ bền nhũ tương

Quan sát vạch phân pha của nhũ tương Đồng hóa

Chất nhũ hóa

Polymer Nước

Dầu gấc

Tween 80 (5%) Tween 80 (10%) Span 80 (5%) Span 80 (10%)

Thuyết minh:

Thí nghiệm được tiến hành với 4 mẫu nhũ tương sử dụng các chất nhũ hóa với nồng độ chất nhũ hóa khác nhau. Mỗi mẫu được cho vào một ống nghiệm, sau đó để trong tủ ấm 37⁰ và quan sát vạch phân pha của chúng. Các mẫu được sử dụng trong thí nghiệm này là :

Mẫu 1 (M1) sử dụng chất nhũ hóa là Tween 80 (5%)

Mẫu 2 (M2) sử dụng chất nhũ hóa là Tween 80 (10%)

Mẫu 3 (M3) sử dụng chất nhũ hóa là Span 80 (5%)

Mẫu 4 (M4) sử dụng chất nhũ hóa là Span 80 (10%)

Tiến hành đánh giá cảm quan các mẫu nhũ tương sau khi quan sát vạch phân pha của chúng.

2.3.3 Nghiên cứu thăm dò ảnh hưởng của nồng độ polymer đến khả năng tạo hạt và chất lượng hạt tạo thành. hạt và chất lượng hạt tạo thành.

Mục đích của thí nghiệm:

Xác định ảnh hưởng của nồng độ polymer đến khả năng tạo hạt của nhũ tương và chất lượng hạt tạo thành.

Chọn được nồng độ polymer thích hợp nhằm: - Tăng khả năng tạo hạt

- Giúp hạt tạo thành có chất lượng cao nhất

Sơ đồ 2.3 Thí nghiệm thăm dò ảnh hưởng của nồng độ polymer đến khả năng tạo hạt

Tạo hạt vi nang Đồng hóa Khuấy từ

Polymer (Gelatine kết hợp carrageenan) Dầu gấc Span 80 (10%)

Nước

Đánh giá cảm quan

Phơi khô ở nhiệt độ thường ……..

Đánh giá cảm quan hạt vi nang và xác định hiệu quả bao gói Carrageenan

0.1% 0.5% Gelatin

Thuyết minh:

Thí nghiệm được tiến hành với 8 mẫu ở 8 nồng độ polymer khác nhau. Mỗi mẫu tạo hạt với thể tích là 2ml và được dùng pipet 5000 để hút rồi nhỏ từng giọt vào cốc chứa nước đá lạnh. Các mẫu được tạo hạt ở các nồng độ polymer là:

Mẫu 1 (M1) nồng độ polymer là gelatin 20% kết hợp carrageenan 0.1%

Mẫu 2 (M2) nồng độ polymer là gelatin 15% kết hợp carrageenan 0.1%

Mẫu 3 (M3) nồng độ polymer là gelatin 10% kết hợp carrageenan 0.1%

Mẫu 4 (M4) nồng độ polymer là gelatin 5% kết hợp carrageenan 0.1%

Mẫu 5 (M5) nồng độ polymer là gelatin 20% kết hợp carrageenan 0.5%

Mẫu 6 (M6) nồng độ polymer là gelatin 15% kết hợp carrageenan 0.5%

Mẫu 7 (M7) nồng độ polymer là gelatin 10% kết hợp carrageenan 0.5%

Mẫu 8 (M8) nồng độ polymer là gelatin 5% kết hợp carrageenan 0.5% Tiến hành đánh giá cảm quan hạt tạo thành sau khi tạo hạt và xác định hiệu quả bao gói của sản phẩm.

Mỗi mẫu ta lặp lại thí nghiệm 3 lần và lựa chọn ra nồng độ polymer thích hợp nhất.

2.3.4 Nghiên cứu thăm dò ảnh hưởng của nhiệt độ tạo hạt đến hiệu quả tạo hạt và chất lượng hạt tạo thành và chất lượng hạt tạo thành

Mục đích của thí nghiệm:

Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng tạo hạt của nhũ tương

Chọn được nhiệt độ tạo hạt thích hợp nhằm: - Tăng khả năng tạo hạt

- Giúp hạt tạo thành có chất lượng cao nhất

Sơ đồ 2.4 Thí nghiệm thăm dò ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng tạo hạt

Tạo hạt vi nang Đồng hóa Khuấy

Polymer (Gelatine và carrageenan) Dầu gấc Span 80 (10%) Nước Nhiệt độ 2⁰C Đánh giá cảm quan Nhiệt độ 5⁰C Nhiệt độ 8⁰C Nhiệt độ 11⁰C Nhiệt độ 14⁰C

Phơi khô ở nhiệt độ thường ……..

Thuyết minh:

Thí nghiệm được tiến hành với 5 mẫu ở 5 nhiệt độ tạo hạt khác nhau. Mỗi mẫu tạo hạt với thể tích là 2ml và được dùng pipet để hút rồi nhỏ từng giọt vào cốc