đông lạnh phôi theo phương pháp thủy tinh hóa (Vitrification method) của George E. Seidel (Colorado State University).
Bước 1: Chuẩn bị phôi bò
Phôi bò sau khi thu hoạch, ựánh giá phân loại những phôi ựúng giai ựoạn phát triển và ựủ tiêu chuẩn loại A, B ựược dùng cho ựông lạnh.
Bước 2: Chuẩn bị môi trường và cọng rạ
Môi trường H (môi trường cơ bản): Syngrod (Bioniche Animal Health) + polyvinyl alcohol 0,1%.
Môi trường V1: Môi trường cơ bản H+EG; thêm 4,2ml EG 5M vào 10,8ml môi trường cơ bản H.
Môi trường V2: Môi trường H + EG 7M + Ficoll 70 18% + Galactose 0.5M. Cho 15ml môi trường H vào ống ựong, thêm 19,5ml EG 7M, 9g Ficoll 70 18% và 4,5g Galactose, khuấy trộn trên máy khuấy từ ựể qua ựêm với nhiệt ựộ 35ỨC cho ựến khi galactose ựược hòa tan. Sau khi galactose ựược hòa tan thêm môi trường H cho ựủ 50ml.
Môi trường D: Môi trường H+Galactose 1M, cho 35ml môi trường H vào ống ựong, thêm 9g Galactose vào hòa tan hoàn toàn Galactose. Sau ựó cho thêm môi trường H cho ựến 50ml. Tất cả các môi trường ựều ựược lọc vô trùng ngoại trừ V2.
Chuẩn bị cọng rạ (trước khi cho phôi vào môi trường V2), hút 1cm môi trường D tiếp theo 0,5cm không khắ, 7cm môi trường D, 0,5cm không khắ,
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 40 tiếp theo giọt 15ộl của V2 chứa phôi, 0,5 cm không khắ, và môi trường D ở cuối cọng rạ.
Trên cọng rạ phải ghi một số thông tin cần thiết về phôi như giống, số lượng phôi, chất lượng phôi, giai ựoạn phát triển của phôi.
1cm 7cm 15 ộl đầu cuối
Nút bông Không khắ Nút cọng rạ Môi trường D Môi trường V2 Phôi
Hình 3.2: Mô hình cọng rạ chứa phôi
Bước 3: Tiến hành ựông lạnh
Chuyển phôi vào trong 0,5ml môi trường H ở ựĩa 4 giếng.
Chuyển phôi vào 0,5ml môi trường V1 ở ựĩa 4 giếng trong vòng 3 phút. Chuyển phôi vào giọt 15ộl môi trường V2 (không phủ dầu khoáng) trong vòng 45 giây, 2-3 phôi/giọt.
Sau 45 giây, cho cọng rạ vào trong hơi Nitơ lỏng với thời gian 1 phút, rồi nhúng cọng rạ trực tiếp vào trong Nitơ lỏng.
Bước 4: Giải ựông phôi
Lấy cọng rạ trong bình Nitơ ra ngoài không khắ trong vòng 8 giây, sau ựó cho vào nước ấm 35-370C trong vòng 15 giây. Cầm phắa ựầu cotton cọng rạ và lắc 4 lần.
Có thể cấy truyền phôi trực tiếp trong vòng 3-10phút (1 hoặc 2 phôi/cọng rạ) hoặc chuyển phôi vào trong môi trường nuôi cấy (rửa 3 lần trong môi trường HEPES-TALP và nuôi trong môi trường có chứa 10% FCS và 50ộl dithiothreitol ở ựiều kiện 38,50C, 5% CO2, ựộ ẩm tối ựa sau 3 giờ
hoặc 24 giờ, ựánh giá chất lượng phôi và sự phát triển của phôi sau ựông lạnh.