Chọn bò cái cho phôi
Chọn 7 bò cái tại Bắc Kạn, ở ựộ tuổi 24-36 tháng, ựưa về nuôi ở trung tâm Thực nghiệm và Bảo tồn vật nuôi, viện Chăn nuôi.
Những bò này ựạt các tiêu chuẩn sau:
Có tầm vóc khỏe mạnh, sức khoẻ tốt, khối lượng cơ thể 250-300kg, nhanh nhẹn, không hung dữ và ựã ựược tiêm phòng ựịnh kỳ các bệnh theo quy ựịnh. Không mắc bất cứ một khuyết tật hoặc một bệnh di truyền nào.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 30 Bộ phận sinh dục không bị viêm, buồng trứng mềm và hoạt ựộng nhạy cảm, trên buồng trứng có thể vàng phát triển tốt.
Khả năng sinh sản tốt, chu kỳ ựộng dục bình thường, biểu hiện các giai ựoạn của chu kỳ rõ ràng. Bò có ắt nhất hai chu kỳ ựộng dục trước ựó ựược phát hiện với khoảng cách chu kỳ 20-21 ngày, dao ựộng 17-24 ngày. Cổ tử cung dễ dàng thực hiện việc ựưa các dụng cụ thu phôi ựi qua.
Gây rụng trứng nhiều
Gây siêu bào noãn hay gây trứng rụng nhiều trứng là một quá trình tác ựộng ựể một lần ựộng dục buồng trứng bò có nhiều trứng phát triển, chắn và rụng ựồng thời. Áp dụng các sơ ựồ sử dụng hormone ựể gây rụng trứng nhiều với PMSG và FSH.
Phương pháp gây rụng trứng nhiều
Chuẩn bị dụng cụ và hormone (CIDR và FSH, PG, Estradiol) đặt CIDR vào xoang âm ựạo (ngày ựặt là ngày 0 của quy trình)
Tiêm FSH từ ngày thứ 10 kể từ khi ựặt CIDR theo liều giảm dần 3 ml; 2,5ml; 2,0ml; 1,5ml lần lượt cho 4 ngày tiếp theo (ngày 10, ngày 11, ngày 12, ngày 13) mỗi ngày tiêm bắp 2 lần vào buổi sáng và buổi chiều với khoảng cách 12 giờ.
Ngày thứ 12 tiêm 2ml FSH và tiêm 5ml PGF2α (ựồng thời rút CIDR vào buổi sáng).
Ngày thứ 14 sau khi tiêm theo dõi ựộng dục và thụ tinh nhân tạo bằng tinh bò HỖMông ựông lạnh ựã ựược giải ựông.
Thu hoạch phôi vào ngày thứ 7 sau khi phối giống bằng phương pháp không phẫu thuật.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 31 Lọc dung dịch rửa phôi, soi tìm phôi trên kắnh hiển vi soi nổi, ựánh giá chất lượng phôi sau khi thu hoạch ngày thứ 7 ứng với giai ựoạn phôi dâu và phôi nang, ựây là giai ựoạn thắch hợp cho ựông lạnh bảo quản và cấy truyền.
Sau khi thu phôi, tiêm PGF2α cho bò thu phôi, sau 8-14 ngày tiến hành ựặt CIDR lặp lại quy trình như trên lần tiếp theo.
Bảng 3.1: Quy trình gây rụng trứng nhiều
Ngày thứ Thời gian tiêm Liều tiêm FSH giảm dần (FSH hoặc super-ov) 0
(ựặt PRID hoặc CIDR)
10 Sáng Chiều 3 ml FSH 3 ml FSH 11 Sáng Chiều 2.5 ml FSH 2.5 ml FSH 12 Sáng Chiều 2ml FSH
Rút PRID hoặc CIDR 2ml FSH và 5ml PGF2α
13 Sáng
Chiều
1,5 ml FSH 1,5 ml FSH
14 Chiều động dục-phối giống
15 Sáng động dục-phối giống
21 Sáng Thu hoạch phôi
Thụ tinh nhân tạo
để thụ tinh nhân tạo chúng tôi tiến hành phối giống bằng tinh bò ựực HỖMông ựông lạnh với hoạt lực của tinh trùng A (%) >40%, nồng ựộ 28-30
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 32 triệu tinh trùng/ml. (Bò HỖMông ựực ựược mua từ Bắc Kạn ựưa về trung tâm Moncada ựể khai thác tinh).
Chuẩn bị dụng cụ
Gồm bình Nitơ chứa tinh và Nitơ, súng bắn tinh, dẫn tinh quản (vỏ nhựa ựể bọc súng bắn tinh-ống gen), găng tay, vazơlin, cồn 700, panh kẹp, cốc ựể ựựng nước làm tan băng hoặc cốc làm tan băng chuyên dụng, nhiệt kế, giấy vệ sinh, sổ sách ghi chép.
Giải ựông tinh dịch
Chuẩn bị nước ấm 35-380C ựể tan băng, không ựược vượt quá 400C vì sẽ làm chắn tinh trùng. Có thể sử dụng dụng cụ làm tan băng bằng ựiện và theo dõi nhiệt ựộ thắch hợp bằng ựèn báo hiệu.
Mở nắp bình Nitơ, gác nắp lên miệng bình, nâng cóng ựựng tinh lên cách miệng bình 5cm, dùng panh kẹp lấy cọng tinh trong vòng 10 giây. Bỏ ngay cọng tinh vào cốc làm tan băng theo chiều ựầu bông xuống dưới và ựậy nắp bình lại vị trắ cũ, thời gian làm tan băng trong vòng 30 giây.
Lưu ý: Thời gian từ khi cọng tinh ựã tan băng ựến khi hoàn thành công việc phối giống không chậm hơn 10 phút, tinh ựã làm tan băng không ựược bỏ lại vào bình chứa tinh.
Chuẩn bị súng bắn tinh
Trong thời gian làm tan băng, tranh thủ chuẩn bị súng bắn tinh, nếu trời lạnh thì nên dùng giấy vệ sinh chà xát nhiều lần vào súng ựể nâng nhiệt ựộ của súng lên. Kéo pắt-tông ra một khoảng ắt nhất 13cm và ựể ở vị trắ thuận lợi, sạch sẽ chuẩn bị sẵn sàng cho việc nạp cọng tinh vào súng.
Nếu dẫn tinh quản có nút tiếp nhận bên trong thì kiểm tra lại vị trắ sao cho nút tiếp nhận nằm cách ựầu dẫn tinh quản khoảng 2-3cm.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 33
Lưu ý: Kiểm tra ựầu vỏ dẫn tinh quản có bị nứt hay không, nếu nứt thì bỏ, vỏ dẫn tinh quản chỉ sử dụng một lần.
Nạp cọng tinh vào súng
Sau thời gian giải ựông tinh, dùng giấy lau khô cọng tinh, kiểm tra lại thông tin trên cọng tinh (giống bò, số hiệu bò ựực). Nếu các thông tin ghi trên cọng rạ bị nhòe và không ựọc ựược các ký hiệu ghi trên cọng rạ thì không nên sử dụng.
Cầm cọng rạ phắa ựầu hàn vẩy nhẹ 3 lần ựể dồn tinh về phắa kia, cắt cọng rạ phắa ựầu hàn, vết cắt phải vuông góc và sắc ngọt ựể không bị dập bẹp, không bị chéo. Nếu cắt bằng kéo thì cắt xong dùng tay xoe nhẹ ựầu cắt cho tròn. đưa cọng rạ phắa ựã cắt vào "nút tiếp nhận" nằm trong vỏ dẫn tinh quản, xoay nhẹ cho chặt. đẩy cọng rạ trượt vào lòng dẫn tinh quản, ựể cọng rạ dư ra ngoài dẫn tinh quản khoảng 1-2cm.
Lưu ý: Khi ựẩy cọng rạ vào phải từ từ, nhẹ nhàng tránh cong hoặc cụp cọng rạ. Trong trường hợp dẫn tinh quản không có "nút tiếp nhận" thì ựưa ựầu bông của cọng rạ vào ựầu súng, cho dư ra 2-3cm.
Lắp vỏ dẫn tinh quản vào súng bắn tinh
đưa vỏ dẫn tinh quản vào súng, ựẩy thân súng trượt ựến ựầu tận cùng của dẫn tinh quản. Cố ựịnh dẫn tinh quản vào súng, tuỳ theo từng loại súng mà ta có cách cố ựịnh phù hợp. Cố ựịnh xong, nhẹ nhàng ựưa pắt-tông vào ựầu bông cọng rạ. Hướng ựầu dẫn tinh quản lên trên ngang với tầm mắt, nhẹ nhàng ựẩy pắt-tông từ từ cho phần không khắ còn lại trong cọng rạ ra ngoài, khi thấy có một chút tinh dịch trồi lên ựầu dẫn tinh quản là ựược. Khi xong, quấn giấy vệ sinh vào ựầu súng và giắt vào người hoặc ngậm ngang miệng ựể tránh súng bị nhiễm bẩn. Khi gặp thời tiết lạnh thì việc giắt súng vào người là rất có hiệu quả.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 34
Dẫn tinh cho bò cái
Dùng nước rửa sạch phần sau của bò cái sau ựó dùng giấy vệ sinh thấm khô nước vùng HỖMông và âm môn bò.
Người thực hiện ựeo găng tay vào tay trái, khi ựến gần bò nên ựứng chéo 1 góc 450 và chân trái bước lên trước. đưa tay ựeo găng vào trực tràng thì chụm bàn tay lại và ựưa theo hướng bàn tay úp xuống. Nếu bò có phản xạ rặn thì ngừng lại chờ ắt phút, khi bò nới lỏng cơ thắt hậu môn thì cho tay từ từ tiến sâu vào. Khi tay ựeo găng ựã ựưa vào ựược trong trực tràng thì tìm cổ tử cung, cố ựịnh cổ tử cung trong lòng bàn tay, kéo nhẹ cổ tử cung về phắa sau cho mép âm hộ bò hé mở, nhẹ nhàng ựưa súng vào âm ựạo. Ban ựầu, hướng súng bắn tinh chếch lên một góc 35-400, khi vào sâu khoảng 10cm (ựể tránh tinh quản vào bàng quang) hoặc khi chạm vào vách trên của âm ựạo thì nâng phần gốc súng lên sao cho thân súng nằm ngang, tiếp tục ựẩy súng thẳng vào theo hướng cổ tử cung. Kết hợp tay ngoài và tay trong ựể hướng súng bắn tinh vào lỗ hoa nở (miệng cổ tử cung), lần lượt ựưa ựầu súng ựi qua hết các nếp gấp cổ tử cung. Dùng ngón tay chỏ ựể kiểm tra ựầu dẫn tinh quản, khi ựầu dẫn tinh quản vừa ra khỏi mặt trước cổ tử cung thì dừng lại và bơm tinh. Khi bơm nên bơm từ từ. Bơm xong, nhẹ nhàng rút súng ra ựồng thời nâng nhẹ cổ tử cung ựể tránh trường hợp tinh chảy ngược lại âm ựạo.
Những thao tác sau khi dẫn tinh
Tháo bỏ găng tay, vỏ dẫn tinh quản, giải phóng bò khỏi gióng cố ựịnh. Vệ sinh và thu xếp dụng cụ, dùng cồn ựể sát trùng súng dẫn tinh.
Ghi chép vào phiếu gieo tinh những số liệu cần thiết như số hiệu bò cái, ngày phối, lần phối, số hiệu ựực giống, theo dõi sự ựộng dục của bò trong chu kỳ tới (sau 19-21 ngày).
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 35
3.3.2.Thu hoạch phôi
Chuẩn bị dung dịch giội rửa, nuôi phôi ngoài cơ thể mẹ
Thu hoạch phôi bằng dung dịch PBS hoặc Ringer lactat bổ sung 1% huyết thanh thai bê hoặc 1-2g BSA/l dung dịch, bổ sung thêm streptomycin. Ủ ấm ở nhiệt ựộ 370C.
Môi trường lưu phôi (PBS+20% FCS) giữ ấm ở nhiệt ựộ 370C.
Chuẩn bị dụng cụ thu hoạch phôi
Gióng giá cố ựịnh bò, phễu lọc phôi vô trùng, màng lọc Microfinter
ựường kắnh (∅) 220ộm lọc môi trường lưu phôi.
đĩa petri ∅ 90mm, ựĩa petri ∅ 30mm, kẻ ô vuông dưới ựĩa ựể giúp cho việc tìm phôi, pipet 10ộl, pipet 5ộl, micropipet.
đầu hút phôi chuyên dụng, ựèn cồn, dao cắt chuyên dụng, bật lửa, bút viết kắnh, Foley catheter, hệ thống ống dẫn, nong tử cung, bơm tiêm, kim tiêm, bông, cồn, giấy chuyên dụng, găng tay vô trùng, chai thủy tinh trung tắnh 500ml bồn nước ấm ổn nhiệt, kắnh hiển vi soi nổi ựộ phóng ựại 40 lần (tất cả dụng cụ này phải ựảm bảo vô trùng).
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 36
Tiến hành thu phôi
Nguyên tắc
đưa dụng cụ lấy phôi Foley catheter qua âm ựạo, cổ tử cung vào sừng tử cung, cố ựịnh Foley catheter tại một vị trắ nhất ựịnh bằng một bóng khắ.
Sau ựó, dung dịch ựược ựưa vào lấy ra theo hệ thống ống khép kắn, hoặc trực tiếp bằng xilanh thông qua Foley catherter. Trứng và phôi ựược ựưa ra ngoài trong quá trình rửa.
Phương pháp thu phôi không phẫu thuật ựược tiến hành từ ngày thứ 6 ựến ngày thứ 7 sau thụ tinh, tốt nhất là ngày thứ 7.
Kiểm tra lại tất cả các dụng cụ.
đưa bò vào giá cố ựịnh tại ựiểm chuẩn bị sẵn, chú ý là 2 chân trước cao hơn 2 chân sau.
Khám và xác ựịnh lại vị trắ, hình dạng, kắch thước của tử cung, xác ựịnh số lượng thể vàng, nang trứng trên buồng trứng.
Dung dịch giội rửa 1000 ml/bò và ựược ngâm hoặc sưởi lên 370C, nối chắnh xác các hệ thống của Foley catheter.
Vệ sinh bò, ựặc biệt là phần âm hộ, hậu môn và ựuôi. Tiêm phong bế gây tê vùng ựuôi.
Tiến hành thu phôi theo phương pháp không phẫu thuật.
Tiến hành
Cố ựịnh bò vào dóng giá, móc bỏ phân, vệ sinh sạch sẽ âm hộ, gây tê khấu ựuôi bằng novocain 3% (dao ựộng từ 3-10ml tùy từng cá thể), tiến hành khám buồng trứng qua trực tràng và ựếm số lượng thể vàng của buồng trứng qua ựó ựánh giá số trứng rụng ựể dự ựoán số lượng phôi thu ựược. Lau khô sạch âm hộ bò, sau ựó lau lại bằng cồn 700.
Làm ướt Foley catheter bằng dung dịch rửa, ựưa Foley catheter vào sừng tử cung, bơm khắ vào bóng Foley catheter (lượng khắ dao ựộng từ 15-20 ml phụ thuộc vào kắch cỡ sừng tử cung của bò), vị trắ bóng khắ ở 1/3 phắa dưới sừng tử cung, rút lõi sắt ra. Sau khi ựã cố ựịnh Foley catheter, nối Foley catheter với hệ thống ống cho dung dịch nước vào và ra.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 37 đóng khóa ựầu dung dịch chảy ra, mở khoá ựầu dung dịch chảy vào. Khi sừng tử cung ựầy dung dịch, ựóng khóa ựầu dung dịch chảy vào, massages nhẹ nhàng tử cung, ựặc biệt là chóp sừng tử cung. Mở khoá chảy ra, dung dịch sẽ ựược chảy vào bình thu phôi hoặc phễu lọc phôi.
Lượng dung dịch mỗi lần ra vào khoảng 20-50 ml tuỳ theo kắch thước tử cung và bóng khắ.
Lặp ựi lặp lại khoảng 8-10 lần, lượng dung dịch chảy vào và ra khoảng 400-500 ml là ựủ cho một lần lấy phôi ở một sừng.
Sau khi rửa xong sừng tử cung bên này, thay Folley catheter mới và tiếp tục tiến hành rửa sừng tử cung bên kia với các bước như trên.
Rửa xong hai sừng, thụt rửa tử cung bằng dung dịch sát trùng lugol, Iodine hoặc kháng sinh, sau ựó tiêm 5ml Lutalyse ựể phá thể vàng.
Dung dịch thu ựược, ựưa về phòng thắ nghiệm, tiến hành lọc phôi bằng phễu lọc chuyên dụng và soi tìm phôi trên kắnh hiển vi soi nổi.
Quá trình lọc và soi tìm phôi
Ghi số hiệu bò trên ựĩa thu phôi và chuẩn bị ống hút phôi.
đốt ống thủy tinh trên ngọn ựèn cồn và kéo dài bằng dao cắt chuyên dụng ựể ựường kắnh ống vừa ựủ cho hút phôi.
Sau khi lọc phôi ựưa ựĩa petri ∅ 90mm lên kắnh hiển vi soi nổi ựộ phóng ựại 40 lần ựể tìm phôi.
Tìm phôi bằng cách di chuyển ựĩa theo dạng chữ chi ngang hoặc dọc dựa theo các ô ựó chia ở trên ựĩa petri. Khi thấy phôi phải dùng ống hút phôi chuyển ngay sang môi trường lưu phôi (PBS có chứa 20% FCS).
Tìm kiếm lặp lại 2-3 lần trước khi chuyển sang cho người khác soi tìm lại hoặc tìm phôi trên ựĩa mới.