Nghiên cứu về cơ chế ựông lạnh tế bào, theo ựịnh luật Loi Raoult, ựộ hạ băng ựiểm của dung dịch phụ thuộc vào nồng ựộ các chất hoà tan. Khi hạ nhiệt ựộ, lúc xuất hiện tinh thể nước ựầu tiên là bắt ựầu thay ựổi giai ựoạn ựông băng. điều này chỉ có thể xảy ra khi nhiệt ựộ thấp hơn hoặc bằng ựộ hạ băng ựiểm của dung dịch. Nhiều nghiên cứu cho biết bên trong tế bào chứa hơn 80% nước, nồng ựộ nước này cao hơn bên ngoài tế bào. Vì vậy, sự thay ựổi giai ựoạn ựông lạnh nội bào xảy ra ở nhiệt ựộ thấp hơn nhiệt ựộ bên ngoài.
Trong quá trình ựông lạnh, trước tiên ở môi trường bên ngoài tế bào những tinh thể nước ựược tạo thành, làm tăng nồng ựộ chất hòa tan nhanh chóng. Sự tăng áp suất thẩm thấu này, nước sẽ ựi ra ngoài tế bào, làm giảm thể tắch tế bào. Mức ựộ mất nước tế bào phụ thuộc vào tốc ựộ ựông lạnh (hạ nhiệt nhanh hay chậm), tốc ựộ này phải ở trên tốc ựộ giới hạn, mà tốc ựộ giới hạn lại thay ựổi theo loại tế bào, khả năng tạo băng ựá nội bào tăng lên cũng gây ra những tổn hại tế bào do ựông lạnh hay giải ựông. Tốc ựộ lạnh ở dưới tốc ựộ giới hạn thì sự sống của tế bào gắn liền với sự biến ựổi các tắnh chất của dung dịch, trong ựó nồng ựộ chất hoà tan cũng ựồng thời tăng lên ở bên ngoài tế bào. Trong môi trường huyền phù (vừa thể lỏng vừa tinh thể) nước tạo thành băng ựá một cách từ từ và bên trong tế bào sẽ mất nước ựể duy trì sự cân bằng áp suất thẩm thấu với bên ngoài tế bào, mọi trao ựổi chất của tế bào ngừng hoạt ựộng, tế bào sống tiềm sinh. Như vậy, sự hiện diện của tinh thể
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 22 nước ựá nội bào và những hiệu ứng của dung dịch là hai yếu tố chủ yếu chuyển biến theo tốc ựộ ựông lạnh ựể quyết ựịnh khả năng sống sót của tế bào.
Tốc ựộ làm lạnh ảnh hưởng ựến các hiện tượng vật lý xảy ra tiếp theo bên trong tế bào. Nếu nhiệt ựộ giảm chậm, tế bào có khả năng mất nước nhanh do ngoại thẩm thấu làm tăng nồng ựộ các chất nội bào ựủ ựể loại bỏ nhiệt ựộ lạnh chưa tạo ựá và duy trì tiềm năng các chất hoá học nội bào cân bằng với tiềm năng các chất hóa học ngoại bào. Kết quả tế bào mất nước và không ựông lạnh bên trong tế bào. Nhưng nếu tế bào ựược ựông lạnh quá nhanh, nó không có khả năng mất nước nhanh ựể duy trì cân bằng, vì vậy nhiệt ựộ lạnh chưa tạo ựá (supercooling) tăng lên và cuối cùng ựạt ựược sự cân bằng bằng việc ựông lạnh nội bào.
Có nhiều chất bảo vệ lạnh ựược sử dụng với các nồng ựộ khác nhau và thường ựược dùng kết hợp với nhau. Những chất bảo vệ lạnh ựược dùng phổ biến hiện nay gồm glycerol và dimethylsulphoxide (DMSO) và một số glycol (ethylene glycol, propylene glycol...).
Glycerol (C3H5(OH)3) có phân tử lượng 92, có tắnh ựộc nhẹ, có tác dụng như một chất chống ựông, có khả năng thẩm thấu cao qua màng tế bào, hòa tan trong nước và cồn. Trong quá trình cân bằng, glycerol xâm nhập vào bên trong tế bào thay thế các phân tử nước thấm xuất ra ngoài tế bào làm cho tế bào không bị giảm dung tắch. Khi vào bên trong tế bào, các phân tử glycerol nằm xen kẽ với các phân tử nước, nên nước ựóng băng ở dạng nha, loại trừ ựược sự giãn nở của tinh thể nước có kắch thước lớn, ngăn cản ựược sự phá vỡ màng và tế bào. Vì vậy mà glycerol giữ ựược sự ổn ựịnh về nồng ựộ của các chất hoà tan, không làm thay ựổi áp suất thẩm thấu và hạn chế sự phá hủy protein của tế bào trong quá trình ựông lạnh.
Ethylene glycol (EG) có phân tử lượng thấp hơn (62,07) so với của glycerol, chất này có tác dụng tương tự glycerol và có thể dùng thay thế cho
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 23 glycerol trong ựông lạnh phôi bò. Ưu ựiểm của việc dùng ethylene glycol trong ựông lạnh phôi bò là khi giải ựông không cần rút chất này ra khai phôi bò theo các bước mà chất này tự thẩm xuất ra ngoài (Voelkel và Hu, 1992).
đường (sucrose, lactose) và protein (bovine serum albumin, hyaluronic acid) cũng ựược dùng như những chất bảo vệ lạnh nhưng chúng thường ựược dùng với các chất bảo vệ lạnh khác.
Kasai (1996) ựã tổng kết rằng, các phòng thắ nghiệm trên thế giới có thể sử dụng một chất bảo vệ lạnh duy nhất hoặc sử dụng kết hợp nhiều chất bảo vệ lạnh như dimethyl sulphoside, acetamide, propylene glycol, glycerol, ethylene glycol, polyethylene glycol, BSA, sucrose, trehalose và glucose với các nồng ựộ khác nhau ựể ựông lạnh phôi ựông vật có vú.
Theo Nguyen (1997), việc sử dụng các chất bảo vệ lạnh và khả năng sống của phôi ựông lạnh có sự khác nhau giữa các loài. đối với thỏ, khả năng sống của phôi ựông lạnh trong hỗn hợp sucrose và glycerol hay DMSO rất thấp (0-5%) so với ựông lạnh bằng propaneol (92%). đối với phôi dâu-phôi nang bò, sử dụng chất bảo vệ lạnh propaneol tốt hơn so với sử dụng glycerol (75% so với 0,0%). Trong khi ựó, phôi bò ựược ựông lạnh trong hỗn hợp chất bảo vệ lạnh sucrose-glycerol có tỷ lệ sống cao hơn so với trong hỗn hợp sucrose-propaneol (65% so với 0,0%). Sự khác biệt về khả năng sống của phôi khi sử dụng các chất bảo vệ lạnh khác nhau giữa các loài khác vẫn chưa có nhiều kết quả nghiên cứu.
Với quan ựiểm sinh học lạnh, các tế bào phôi không khác biệt với các loại tế bào sống khác. điều quan trọng nhất của quá trình ựông lạnh là loại bỏ nước nội bào trước khi chúng ựược ựông lạnh. Các nghiên cứu về kỹ thuật ựông lạnh nghiên cứu về loại chất bảo vệ lạnh và nồng ựộ sử dụng của chúng, tốc ựộ hạ nhiệt ựộ, nhiệt ựộ tạo ựá và nhiệt ựộ chuyển phôi sang Nitơ lỏng cũng như nhiệt ựộ và tốc ựộ giải ựông.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 24 Theo nghiên cứu trước ựây, ựông lạnh phôi có thể chia làm 2 phương pháp là ựông lạnh chậm và ựông lạnh nhanh. đông lạnh chậm là phương pháp mà ở ựó quá trình làm mất nước nội bào và việc hạ nhiệt ựộ có kiểm soát xảy ra chậm trước khi phôi ựược chuyển vào bảo quản trong Nitơ lỏng. đối với phương pháp ựông lạnh chậm, phôi ựược chuyển vào môi trường có chất bảo vệ lạnh theo nhiều bước với nồng ựộ chất bảo vệ lạnh tăng dần hay chuyển thẳng vào môi trường có nồng ựộ chất bảo vệ lạnh thắch hợp. Thời gian cân bằng trong phương pháp này thường 10-30 phút. Sau ựó cọng rạ chứa phôi ựược chuyển ngay vào máy ựông lạnh và việc tạo ựá ựược thực hiện ở nhiệt ựộ -30C ựến -70C. Tạo tinh thể ựá (seeding) là thuật ngữ dùng ựể mô tả việc hình thành ựá có kiểm soát ở nhiệt ựộ lạnh, bằng cách dùng panh ựã ựược nhúng trước vào Nitơ lỏng chạm vào thành của cọng rạ. Ngay sau khi tạo tinh thể ựá, ựá sẽ ựược hình thành nhanh chóng trong toàn bộ cọng rạ chứa phôi, và việc hạ nhiệt ựộ vẫn ựược thực hiện với tốc ựộ 0,30C/phút xuống -350C, từ nhiệt ựộ này, phôi ựược chuyển vào Nitơ lỏng ựể bảo quản (Saitoh và cs, 1995).
Phương pháp ựông lạnh nhanh là phương pháp ựông lạnh mà thời gian từ lúc khử nước nội bào ựến lúc kết thúc quá trình ựông lạnh xảy ra rất nhanh. Phôi sau khi ựã ựược khử nước nội bào ựược chuyển thẳng vào niơ lỏng mà không cần phải sử dụng máy ựông lạnh có kiểm soát nhiệt ựã ựược lập trình sẵn.
Một trong những phương pháp ựông lạnh nhanh ựược nghiên cứu rộng rãi là phương pháp thủy tinh hoá (vitrification). Thủy tinh hoá là thuật ngữ chỉ quá trình ựông cứng mà không tạo thành tinh thể ựá không có sự cô ựọng các chất hòa tan như trong các phương pháp ựông lạnh truyền thống, có sự tăng ựột ngột sự ựặc quánh (viscosity) trong môi trường lưu phôi, tạo nên chất rắn dạng thủy tinh. Phương pháp ựông lạnh thủy tinh hóa lần ựầu ựược Rall và
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 25 Fahy ựề xuất năm 1985. Sau ựó, phương pháp này ựã ựược nhiều tác giả nghiên cứu thành công ựể ựông lạnh phôi ựông vật có vú (Kasai, 2002).
Ưu ựiểm của phương pháp này là thời gian ựông lạnh nhanh, không cần thiết bị ựông lạnh ựắt tiền và ựiều quan trọng là tỷ lệ sống của phôi sau khi ựông lạnh-giải ựông cao. Gần ựây, George E. Seidel (Colorado State University) ựã nghiên cứu cải tiến phương pháp ựông lạnh thủy tinh thể (Vitrification method) phôi bò cực nhanh bằng Syngrod (Bioniche Animal Health)+polyvinyl alcohol 0,1% (w/v), Ethylene Glycol (EG), Galactose. Thời gian cân bằng ở nhiệt ựộ phòng trong vòng 45 giây, cọng rạ chứa phôi ựược khử nước một phần trên hơi Nitơ lỏng trong 1 phút với mục ựắch nâng cao tỷ lệ phôi sống sau ựông lạnh và giải ựông.