Trình tự đoạn gen mã hóa 16S rRNA của chủng BTL4 đã được xác định trên máy đọc trình tự tự động ABI PRISM 3100. Sau khi phân tích và xử lý số liệu, chúng tôi thu được trình tự đoạn gen16S rRNA được trình bày trên hình 3.7
M 1 1,5 Kb M: Thang DNA chuẩn kích thước 1kb 1: Sản phẩm cắt DNA plasmid của dòng số 2
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
1 cgggtgagta acgcgtggga atatgccctt tggtacggaa tagtcctggg aaactggggg 61 taataccgta tgcgcccttc gggggaaaga tttatcgcca aaggattagc ccgcgttgga 121 ttaggtagtt ggtggggtaa tggcctacca agccgacgat ccatagctgg tttgagagga 181 tgatcagcca cactgggact gagacacggc ccagactcct acgggaggca gcagtgggga 241 atcttagaca atgggggcaa ccctgatcta gccatgccgc gtgagtgatg aaggccctag 301 ggttgtaaag ctctttcagc tgggaagata atgacggtac cagcagaaga agccccggct 361 aactccgtgc cagcagccgc ggtaatacgg agggggctag cgttgttcgg aattactggg 421 cgtaaagcgc acgtaggcgg accggaaagt tgggggtgaa atcccggggc tcaaccccgg 481 aactgccttc aaaactatcg gtctggagtt cgagagaggt gagtggaatt ccgagtgtag 541 aggtgaaatt cgtagatatt cggaggaaca ccagtggcga aggcggctca ctggctcgat 601 actgacgctg aggtgcgaaa gcgtggggag caaacaggat tagataccct ggtagtccac 661 gccgtaaacg atgaatgcca gtcgtcgggc agcatgctgt tcggtgacac acctaacgga 721 ttaagcattc cgcctgggga gtacggtcgc aagattaaaa ctcaaaggaa ttgacggggg 781 cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgcagaac cttaccaacc 841 cttgacatcc caggaccggc ccggagacgg gtctttcact tcggtgacct ggagacaggt 901 gctgcatggc tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgtttcg gttaagtccg gcaacgagcg 961 caacccacac ttccagttgc catcatttgg ttgggcactc tggaagaact gccgatgata 1021 agtcggagga aggtgtggat gacgtcaagt cctcatgggc ccttacgggt tgggctacac 1081 acgtgctaca atggtggttg acaggtgggg ttattcccaa aaggcatctc agttcggatt 1141 ggggtcttgc actcgaccca tgagttggat ccgctagtta ttcgcggaac agcatgcgcg 1201 ggtgattacg tttcctgggc ttgttacaca ccgccggtca cacatgggga gttgggttct 1261 accgacggcg tgcgcttaca gcatgggggc agcggaccgg tagg
Hình 3.7: Kết quả giải trình tự đoạn gen 16S rRNA của chủng BTL4
Dựa vào việc so sánh trình tự đoạn gen 16S rRNA của chủng vi khuẩn BTL4 với trình tự các chủng vi sinh vật prokaryote chuẩn khác trên LPSN (List of Prokaryotic names with Standing in Nomenclature), chúng tôi đã thống kê mức độ tương đồng của các chủng so sánh (bảng 3. 3) và xây dựng cây phát sinh chủng loại của chủng vi khuẩn này (hình 3. 8).
Từ bảng so sánh trình tự đoạn gen 16S rRNA chúng tôi nhận thấy chủng
BTL4 có quan hệ gần với các chung thuộc chi Paracoccus. Dựa trên việc so sánh
nucleotide nhận thấy chủng BTL4 có quan hệ gần gũi với chủng Paracoccus chúng
tôi đặt tên chủng này là Paracoccus sp. BTL4. Chủng vi khuẩn này được đăng ký
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 3.3: Mức độ tƣơng đồng của BTL4 so với một số chủng vi khuẩn
TT Tên chủng vi khuẩn Mã số trên NCBI Mức độ tƣơng đồng
1 Paracoccus alcaliphilus AY01417 93%
2 Paracoccus aminophilus AY01417 93%
3 Paracoccus aminovorans D32240 94%
4 Paracoccus bengalensis AJ864469 97%
5 Paracoccus carotinifaciens AB006899 91%
6 Paracoccus denitrificans Y16927 95%
7 Paracoccus sp. 22-5 GQ260189 93%
8 Paracoccus versutus AY014174 97%
9 Paracoccus halophilus DQ423482 94%
Hình 3.8: Cây phát sinh chủng loại của chủng BTL4
Paracoccus versutus(AY 014174)
Paracoccus bengalensis (AJ 864469)
Paracoccus. sp.BTL4 (AB646256)
Paracoccus versutus (DQ423482)
Paracoccus denitrificans (Y 16927)
Paracoccus aminophilus (AY 014176)
Paracoccus aminovorans (D 32240)
Paracoccus carotinifaciens (AB006899)
Paracoccus sp. 22-5 (GQ 260189)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Trên thế giới một số nghiên cứu về khả năng phân hủy PAH của chi
Paracoccus đã được công. Theo nghiên cứu của Jian và các cộng sự vào năm 2009
chủng Paracoccus aminovorans HPD-2 được phân lập từ trong đất nhiễm PAHs,
sau 14 ngày nuôi cấycó khả năng phân hủy 36% PAH có 3 vòng thơm, 26% PAH
có 5 vòng thơm [31]. Còn theo nghiên cứu đã được công bố vào năm 2010 của Teng
Y và các cộng sự về khả năng phân hủy PAH của Paracoccus sp. strain HPD-2
được phân lập từ đất thì chúng có khả năng phân hủy 30,7% PAH 3 vòng thơm, 24,3% PAH 5, 6 vòng thơm [41].
Như vậy, cùng với các chủng vi sinh vật khác chủng Paracoccus. sp BTL4 mà
chúng tôi phân lập được đã góp phần làm phong phú thêm số lượng các chủng vi
khuẩn thuộc chi Paracoccus nói riêng và hệ vi sinh vật có khả năng phân hủy PAH
trong nước thải công nghiệp nói chung, phục vụ cho công nghệ phân hủy sinh học nguồn nước thải sau này. Để xác định hiệu quả phân hủy pyrene của chủng vi khuẩn này trước hết chúng tôi tiến hành xác định các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát sinh trưởng phát triển của chúng.
3.4. Ảnh hƣởng của nhiệt độ, pH đến sự phát triển của chủng BTL4
Việc phân lập và định tên một số chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy PAH trong nước thải nhằm mục đích xác định các điều kiện tối ưu để vi sinh vật đó phát triển, từ đó có thể kiểm soát quá trình phát triển của sinh vật theo mong muốn. Các yếu tố ảnh hướng lớn nhất, trực tiếp nhất đến sự sinh trưởng, phát triển, cũng như khả năng phân hủy PAH của vi sinh vật là nhiệt độ và pH, đồng thời đây cũng là 2 nhân tố dễ kiểm soát nhất. Do đó chúng tôi tiến hành thí nghiệm kiểm tra sự ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến sự phát triển của chủng BTL4.
3.4.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Chủng BTL4 được nuôi cấy trong môi trường Gost dịch có bổ sung 100 ppm
pyrene ở 300
C và 370C trong 6 ngày. Cứ 24h chúng tôi lấy 1ml dung dịch nuôi và
kiểm tra mật độ quang phổ tại bước sóng 620 nm. Kết quả thu được thể hiện trên hình 3.9.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.9: Đồ thị thể hiện sự phát triển của chủng BTL4 ở 300C và 370C
Từ đồ thị chúng ta có thể dễ dàng nhận thấy chủng BTL4 phát triển ở điều
kiện 370C tốt hơn ở điều kiện 300C. Kết luận này trùng với kết quả nghiên cứu của
В.О. Коршунова và Соколова [66]. Thường thì các chủng vi khuẩn có khả năng sinh trưởng phát triển tốt nhất trong khoảng nhiệt độ 28-32, nhưng chủng BTL4 lại
có khả năng phát triển tốt hơn ở 370C điều đó cho thấy đây là chủng có khả năng
chịu được nhiệt độ và nó làm gia tăng giới hạn nhiệt và khả năng phân hủy của tập đoàn vi sinh vật.
3.4.2. Ảnh hưởng của pH
Chủng BTL4 được nuôi cấy trong môi trường gost dịch có pH là 5, 6, 7, 8, 9 ở
370C và bổ sung 100 ppm pyrene. Dịch nuôi cấy cứ sau 24h được rút ra và đo mật
độ quang phổ với bước sóng 620 nm. Kết quả được thể hiện ở đồ thị ở hình 3.10.
Hình 3.10: Đồ thị mật độ quang phổ của chủng BTL4 ở các điều kiện pH
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Từ đồ thị trên ta có thể nhận xét.
Với pH < 6 vi khuẩn không có khả năng tăng sinh khối.
Với pH ≥ 8 trong 24h đầu sinh khối của vi sinh vật không thay đổi, nhưng sau 24h thì sinh khối tăng từ từ, 24h tiếp theo thì sinh khối của vi sinh vật tăng nhanh. Hiện tượng này có thể được giải thích như sau: Theo Sutherland và các cộng sự thì
trong qua trình sống của mình, vi sinh vật phân giải PAH có khả năng tạo ra H+
, do đó, trong ngày đầu pH > 8 vi khuẩn phát triển chậm, nhưng sau đó pH giảm dần đến ngưỡng thích hợp cho vi sinh vật phát triển [52].
Với pH 6-8 pH nằm trong ngưỡng tăng sinh khối và quá trình tăng sinh khối bắt đầu ngay từ ngày đầu.
Vậy chủng BTL4 có khả năng phát triển tốt nhất trong điều kiện pH ở trong khoảng 6-8, điều này phù hợp với nghiên cứu của của Коршунова và Соколова [66].
Sau khi xác định các điều kiện thích hợp cho sự sinh trưởng phát triển của BTL4 chúng tôi tiến hành đánh giá khả năng phân hủy pyrene của chủng này.
3.5. Khả năng phân hủy pyrene của chủng BTL4
Pyrene được biết đến là hợp chất có cấu tạo phức tạp, khối lượng phân tử lớn có chứa 4 vòng benzene trong phân tử, pyrene có độ hòa tan thấp, nhưng có độc tính cao. Chúng tồn tại trong than đá, khói thuốc lá, xăng xe… Và trở thành một trong các nhân tố gây ung thư, đột biến thai nhi… Nồng độ pyrene có trong nước thải khu công nghiệp Từ Liêm là 24 mg/l là tương đối cao và cần phải loại bỏ pyrene ra khỏi nước thải. Để xác định xem ở nồng độ nào chủng vi khuẩn BTL4 có khả năng sử dụng pyrene là tốt nhất, chúng tôi lựa chọn các nồng độ 50, 75, 100, 125, 150 ppm bổ sung vào môi trường nuôi cấy của chủng vi khuẩn này (hình3.11). Kết quả về cảm quan cho thấy, tại nồng độ 100 ppm, chủng BTL4 phát triển nhanh nhất, màu sắc môi trường cũng đổi màu rõ rệt, do vậy chúng tôi đã lựa chọn nồng độ pyrene 100 ppm để xác định khả năng phân hủy của chủng BTL4. Quá trình phân tích được tiến hành tại phòng hóa phân tích thuộc viện hóa học, và kết quả phân tích được thể hiện ở hình 3.12.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.11: Kết quả nuôi BTL4 ở các nồng độ pyrene khác nhau
Hình 3.12: Kết quả phân tích khả năng phân hủy pyrene của chủng BTL4
Dựa vào chiều cao peak tại các điểm hấp thụ pyrene, tại bước sóng 238,9 nm, chúng tôi tính toán được khả năng phân hủy pyrene của chủng BTL4 là 25,5% trong môi trường dịch thể.
Paracoccus được biết đến như là chi vi khuẩn Gram âm, có hình tròn, có khả
năng sống trong môi trường đất, nước [41], [31] [52]. Quá trình trao đổi chất của chúng có thể diễn ra cả trong điều kiện kỵ khí và hiếu khí và chúng thường được phân lập từ đất. Trên thế giới đã công bố một số nghiên cứu về khả năng phân hủy
PAH của chi Paracoccus. Năm 2009 chủng vi khuẩn Paracoccus aminovorans
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
PAH có 3 vòng thơm với hiệu suất 36% mà còn có khả năng phân hủy PAH có 5 vòng thơm với hiệu suất 26% sau 14 ngày nuôi cấy [31]. Còn theo nghiên của Teng
Y và cộng sự (2010) về khả năng phân hủy PAH của Paracoccus sp. strain HPD-2
được phân lập từ đất có khả năng phân hủy 30,7% PAH 3 vòng thơm, 24,3% PAH 5, 6 vòng thơm [41]. So với các chủng này thì BTL4 có khả năng phân hủy pyrene ở mức độ trung bình, điều này cũng hợp lý bởi trong quá trình thí nghiệm chúng tôi không sử dụng chất hoạt động bề mặt, thời gian thí nghiệm cũng ngắn hơn, đồng thời nồng độ ban đầu của pyrene là 100ppm [40].
Ngoài chi Paracoccus, trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về khả
năng phân hủy PAH của các chủng vi khuẩn khác được công bố. Năm 2002,
Deborah và cộng sự đã công bố chủng Mycobacterium sp. PYR-1 phân lập từ trầm
tích bị ô nhiễm có khả năng phân hủy 74% hỗn hợp PAH gồm phenanthrene, anthracene, fluoranthene, pyrene, chrysene và benzo[a]pyrene sau 7 ngày nuôi cấy. Trong đó, 95% fluoranthene bị loại bỏ sau 24h nuôi cấy, tuy nhiên nồng độ ban đầu chỉ có 17 mg/l (17 ppm) [18].
Năm 2007, Xue-Jing Zheng và cộng sự đã nghiên cứu khả năng chuyển hóa sinh học của tập đoàn vi sinh vật hiếu khí có trong bùn cống và bổ sung chất hoạt động bề mặt Tween 80 cho hiệu quả loại bỏ PAH trên 95% đối với PAH chứa 3 vòng thơm và tăng tốc độ loại bỏ PAH chứa 4 vòng thơm sau 21 ngày [60]. Chủng
Rhodococcus sp. được phân lập từ mẫu trầm tích có khả năng phân hủy 53%
anthracene sau 24 giờ ở nồng độ 3 µg/ml [18].
Ở Việt Nam cũng đã có một số công bố của các tác giả trong nước về khả năng phân hủy các PAH của các chủng vi sinh vật phân lập được từ các nguồn khác nhau. Năm 2003, La Thị Thanh Phương và cộng sự đã phân lập được chủng vi khuẩn
Sphingomonas yanoikuyae MXL-9 từ cặn dầu thô mỏ Bạch Hổ (Quảng Ninh) có khả
năng phân hủy 61,4% anthracene sau 7 ngày nuôi cấy ở nồng độ 12 mg/l [9]. Chủng BQN31 phân lập từ mẫu nước nhiễm dầu của bể thu gom xí nghiệp than Quảng Ninh có khả năng phân hủy 69,38% naphthalene và 25,9% anthracene trong môi trường có bổ sung 100 ppm hai loại PAH trên [7].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Năm 2008, Nguyễn Ngọc Bảo và cộng sự đã phân lập được 2 chủng vi khuẩn BDNR1 và BDNR4 từ mẫu đất nhiễm chất diệt cỏ dioxin trong căn cứ quân sự cũ của Mỹ ở sân bay Đà Nẵng. Kết quả nghiên cứu cho thấy chủng BDNR1 phân hủy 50% anthracene, naphthalene, 86,2% pyrene; chủng BDNR4 phân hủy, 23,1% naphthalene, 50% anthracene và 61,5% pyrene trong môi trường có chứa 100 ppm mỗi loại PAH trên [1].
So với các chủng vi khuẩn khác thì chủng Paracoccus có hiệu suất phân hủy
thấp hơn, nhưng để xử lý nước thải của khu công nghiệp chúng ta không phải chỉ cần một chủng đơn mà cần phải có một tập đoàn gồm nhiều loại vi sinh vật khác nhau. Chủng BTL4 góp phần làm giàu thêm nguồn vi sinh vật có thể sử dụng trong xử lý nước thải. Để nghiên cứu khả năng xử lý nước thải trong thực tế của các chủng vi sinh vật đã được phân lập chúng tôi tiến hành thử xử lý nước thải khu công nghiệp Từ Liêm ở quy mô phòng thí nghiệm 5 lít.
3.6. Kết quả mô hình xử lý nƣớc thải ở quy mô 5 lít
Sau khi lấy mẫu nước thải từ khu công nghiệp Từ Liêm chúng tôi tiến hành phân tích một số chỉ tiêu và nhận thấy nước thải từ khu công nghiệp Từ Liêm có nhiều hàm lượng các chất vượt quá chỉ tiêu cho phép của tiêu chuẩn nước thải của khu công nghiệp và cần phải xử lý trước khi được thải vào hệ thống nước thải của thành phố. Thời gian xử lý là 3 đến 7 ngày tùy vào lượng nước thải đầu vào và lượng vi sinh vật trong bể lọc. Sau khoảng thời gian 3 ngày sẽ tiến hành kiểm tra các thông số nước thải xem đã đạt tiêu chuẩn chưa, nếu các thông số đã đạt tiêu chuẩn thì nước từ bể xử lý sinh học được đưa qua bể lọc bùn và bể khử vi sinh vật trước đổ vào bể chứa nước sau xử lý và thải ra hệ thống nước thải của thành phố.
Trong quy mô đề tài này chúng tôi chỉ tiến hành xử lý thử nghiệm ở quy mô 5 lít.
3.6.1. Quá trình hoạt hóa bùn
Tập đoàn vi sinh vật từ lần làm giàu thứ 3 được chúng tôi tiến hành hoạt hóa trong môi trường tự pha có các điều kiện gần giống nước thải thật tại KCN Từ Liêm như đã mô tả ở chương 2 vật liệu và phương pháp.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bắt đầu hoạt hóa bùn Hoạt hóa sau 6 ngày
Hoạt hóa sau 12 ngày Hoạt hóa sau 18-21 ngày
Hình 3.13: Quá trình hoạt hóa bùn sau 3 tuần
Trong thời gian hoạt hóa chúng tôi nhận thấy lượng sinh khối của vi sinh vật tăng lên từng ngày, dịch nuôi dung dịch hoạt hóa ngày càng đục đi, sang đến ngày 18-21 thì dịch chuyển sang màu nâu đỏ và không đổi mầu nữa (hình 3.13), do đó chúng tôi ngừng quá trình hoạt hóa vi sinh vật, để lắng và loại bỏ nước dịch không có bùn, đồng thời giữ lại bùn để tiến hành thí nghiệm xử lý nước thải ở quy mô 5 lít.
3.6.2. Xử lý nước thải ở quy mô 5 lít
Lấy 5 lít nước thải của khu công nghiệp Từ Liêm cho vào bể 10 lít sau đó cho bùn đã được hoạt hóa vào bể và tiến hành sục khí với độ cấp khí là 4 - 5 mg/l, hàm
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
lượng chất rắn lơ lửng từ 1000-1500 mg/l, chỉ số lắng của bùn SVI dao động từ 80 - 100 mg/l. Sau 3 ngày xử lý, chúng tôi nhận thấy nước có sự chuyển màu rõ rệt, từ màu đen sẫm sang màu trắng hình 3.14 D. Sau 5 ngày chúng tôi tiến hành phân tích một số chỉ tiêu, kết quả phân tích được trình bày ở bảng 3.4.
A B
C D
Hình 3.14: Màu sắc của nƣớc thải trƣớc xử lý (A, C) và sau xử lý (B, D) với