Sự phân hủy sinh học PAH phụ thuộc rất nhiều yếu tố.
Nhiệt độ Mỗi chủng vi sinh vật thích hợp ở những nhiệt độ phát triển riêng vì vậy để tối ưu hóa quá trình phân hủy sinh học chúng ta cần nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của vi sinh vật.
pH môi trường cũng là một yếu tố gây ảnh hưởng không nhỏ tới sự phát triển
của vi sinh vật. pH thích hợp nhất cho sự phát triển của vi sinh vật thường từ 5,5 đến 8,5. Tuy nhiên, sự phân hủy sinh học vẫn có thể xảy ra tại một số khu vực với những giá trị pH đặc biệt như tại các môi trường rất acid hay rất kiềm với tốc độ
chậm hơn. Ví dụ đối với Thiobacillus thioxidan là vi sinh vật có khả năng oxy hóa
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Nguồn dinh dƣỡng như Carbon (C), nito (N), phosphor (P) là các chất cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp của của tế bào vi sinh vật. Các muối phosphate và muối nitor có vai trò quan trọng trong việc tổng hợp protein của vi sinh vật. Carbon và nitor luôn có mặt trong đất, tuy nhiên nếu nồng độ của chúng thấp thì không có khả năng kích thích tập đoàn vi sinh vật hoạt động. Đó chính là lý do vì sao trong đất nhiễm chất độc luôn tồn tại tập đoàn vi sinh vật song số lượng và khả năng hoạt động của chúng không cao. Nếu không bổ sung thêm nguồn dinh dưỡng thì vi sinh vật sẽ phân hủy các chất độc ở khu vực ô nhiễm với tốc độ rất chậm. Đây cũng là những nghiên cứu rất cần thiết phục vụ cho quá trình tạo các yếu tố công nghệ thích hợp trong xử lý tẩy độc [53].
Thế oxy hóa khử là thể hiện cho xu hướng của môi trường biến đổi theo hướng oxy hóa hay khử. Các chất nhận điện tử rất cần thiết đối với các vi sinh vật có khả năng phân huỷ chất độc hóa học trong đất. Các chất nhận điện tử này gây nên thế oxy hóa khử của môi trường. Đối với quá trình hiếu khí (quá trình oxy hóa) thế oxy hóa khử vào khoảng +800 mV, còn với quá trình kị khí (quá trình khử) thế oxy hóa khử vào khoảng từ 0-300 mV [53]. Thực tế là các chất nhận điện tử khác nhau giúp cho vi sinh vật có khả năng chịu được những giá trị pH khác nhau.
Ngoài các yếu tố môi trường như trên, sự phân hủy sinh học PAH còn phụ thuộc vào tính chất vật lý, hóa học của các PAH, sự có mặt đồng thời hay riêng rẽ của các PAH trong môi trường. Ngoài ra nó còn phụ thuộc vào bản thân các vi sinh vật, phương thức mà các vi sinh vật chuyển cơ chất qua màng tế bào. Thường những phân tử tan có thể được vận chuyển qua màng tế bào và có khả năng phân hủy sinh học tốt hơn [16, 27, 36, 52, 64].
Các yếu tố môi trường tại nơi mà vi sinh vật được phân lập ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển của chúng. Do vậy, trong quá trình xử lý làm sạch môi trường, vấn đề này đóng vai trò quan trọng và quyết định hiệu quả của việc xử lý. Quá trình phân hủy các hợp chất hydrocarbon thơm đa nhân bởi các vi sinh vật thường xảy ra với tốc độ chậm, do vậy việc tạo điều kiện thích hợp cho tập đoàn vi sinh vật phát
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
triển tốt nhất, có hiệu quả phân hủy sinh học cao có thể coi là chìa khóa của công nghệ phân hủy sinh học.
Theo Yuan và cộng sự (2000), điều kiện tối ưu cho sự phân hủy các PAH của
đối tượng mà tác giả nghiên cứu là 30o
C, pH 7 [63]. Chủng vi khuẩn Alcaligenes
eutrophus JMP134 và Pseudomonas cepacia AC1100 phát triển tốt nhất ở 29o
C [25].
Một số nghiên cứu khác cho thấy chủng Streptomyces danangensis XKDN19 có
khả năng phát triển tốt nhất ở 32oC, pH 6, nồng độ NaCl 0 - 3% [10]; chủng
Streptomyces danangensis XKDN11 ở 30oC, pH 7, nồng độ NaCl 0,5% [3]; chủng
nấm sợi FDN20 ở 28oC, pH 6, nồng độ NaCl 3% [4]. Các yếu tố khác như nguồn
nitơ, photpho, cacbon và các khoáng khác cũng ảnh hưởng đến sự phát triển và phân hủy chất độc của các vi sinh vật.
Nghiên cứu của Nguyễn Bá Hữu và cộng sự (2002) về ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến sự phân hủy các hợp chất hydrocarbon thơm đa nhân của một số
chủng vi khuẩn thuộc chi Pseudomonas, Sphingomonas phân lập từ đất nhiễm dầu
cho thấy các chủng này có khả năng phát triển tốt nhất ở nhiệt độ 30o
C, pH 7 - 7,8 và nồng độ muối NaCl từ 0% đến 3% [5]. Một số tác giả khác cũng phát hiện điều
kiện tối ưu cho phân hủy sinh học PAH ở 30o
C và pH 7 [27, 52, 64]. Trên đây là những kết quả quan trọng trong việc kích thích tập đoàn vi sinh vật bản địa trong đó có vi khuẩn để tiến tới xử lý vùng đất nhiễm độc hóa học.
Trong tự nhiên, thường không tồn tại một loại hydrocarbon thơm đa nhân mà thường tồn tại dưới dạng hỗn hợp. Do đó việc nghiên cứu khả năng phân hủy hỗn hợp các PAH là điều cần thiết để xem ảnh hưởng qua lại của chúng trong hỗn hợp cũng như nồng độ của chúng. Sự tồn tại của các PAH khác nhau có thể thúc đẩy hoặc ức chế quá trình phân hủy sinh học, nồng độ của PAH cao sẽ làm giảm quá trình phân hủy sinh học và gây độc cho vi sinh vật. Các PAH có khối lượng phân tử thấp, cấu trúc đơn giản dễ dàng phân hủy hơn so với các PAH có khối lượng phân tử cao và có cấu trúc phức tạp. Theo Yuan, điều kiện tối ưu cho sự phân hủy các
hydrocarbon thơm đa nhân đối với đối tượng tác giả nghiên cứu là tại nhiệt độ 30o
C, pH 7 [63]. Tác giả Zaidi cùng các cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến sự
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
phân hủy phenanthrene và nhận thấy tại pH từ 6 đến 7 thì không ảnh hưởng mạnh đến khả năng phân hủy, nhưng tại pH 10 thì gây ức chế khả năng phân hủy phenanthrene của vi sinh vật [64].
Sự phân hủy sinh học các PAH riêng rẽ trong mẫu thí nghiệm đã không ngừng được nghiên cứu và ngày càng thu được nhiều kết luận có giá trị [36,63]. Các PAH có cấu trúc phân tử đơn giản, khối lượng phân tử thấp dễ dàng phân hủy sinh học hơn so với các PAH có khối lượng phân tử cao và cấu trúc phức tạp [13,16, 61,63]. Tuy nhiên, chúng ta còn ít hiểu biết về khả năng phân hủy sinh học các PAH khi chúng có mặt đồng thời trong các vùng ô nhiễm. Thường trong tự nhiên không chỉ tồn tại một loại PAH mà tồn tại hỗn hợp các PAH. Do đó, việc nghiên cứu khả năng phân hủy hỗn hợp PAH là điều cần thiết để có thể đánh giá được ảnh hưởng qua lại và tương quan nồng độ của chúng đến sự phân hủy hỗn hợp. Sự tồn tại của các PAH khác nhau có thể thúc đẩy hoặc ức chế quá trình phân hủy sinh học [63]. Yuan cùng cộng sự (2000) tiến hành nghiên cứu khả năng phân hủy đồng thời các PAH trong bùn sông có nhiễm PAH. Kết quả cho thấy, tốc độ phân hủy phenanthrene giảm khi có mặt thêm bất kì một PAH nào trong mẫu. Khi 6 PAH có mặt đồng thời, tốc độ phân hủy phenanthrene, acenaphthalene giảm nhưng tốc độ phân hủy Anthracene, Fluorene và Pyrene lại tăng [61,63].
Ngoài ra, tốc độ phân hủy PAH cũng còn bị ảnh hưởng mạnh bởi các chất hoạt động bề mặt không phân cực như Bij 30, Bij 35, triton X100, triton N110. Các chất này gây độc và ức chế hoạt động của vi sinh vật vì chúng có khả năng tương tác với màng tế bào hay chính xác hơn là các phân tử chất hoạt động bề mặt tương tác với protein màng tế bào [38]. Các chất này cũng có thể trực tiếp gây ức chế hoạt động của các enzyme liên quan tới con đường chuyển hóa PAH. Có thể chúng còn liên kết với cả các enzyme hay với các cơ chất. Một lí do làm giảm khả năng phân hủy sinh học các hợp chất này là chúng hạn chế sự tiếp xúc của tế bào vi sinh vật với các chất hữu cơ hòa tan trên bề mặt [64].
Tóm lại, việc nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sự phân hủy sinh học các hợp chất PAH là rất quan trọng. Có thể coi đây là cơ sở công nghệ cho quá trình xử
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
lý ô nhiễm PAH bằng phương pháp phân hủy sinh học (bioremediation), đảm bảo các điều kiện thuận lợi làm cho tốc độ phân hủy các hydrocarbon đa nhân có thể đạt tới mức tối đa.
1.5. Các phƣơng pháp phân loại vi sinh vật
Vi sinh vật rất đa dạng trong tự nhiên. Tuy nhiên, chỉ một phần nhỏ trong số chúng là có thể nuôi cấy được ở trong điều kiện phòng thí nghiệm. Do đó, việc phân loại chúng gặp nhiều khó khăn. Hiện nay có nhiều phương pháp để phân loại vi sinh vật. Các phương pháp cổ điển chỉ dựa vào các đặc điểm sinh lý, sinh hóa và hình thái cấu tạo bên ngoài để phân loại vi sinh vật, còn phương pháp hiện đại lại chú trọng nhiều đến việc nghiên cứu các phân tử axit nucleic như DNA, RNA để áp dụng trong phân loại. Từ đó có thể thành lập cây phát sinh chủng loại, phản ánh mối quan hệ về mặt tiến hóa giữa các loài với nhau.
1.5.1. Phân loại theo phương pháp cổ điển
Phương pháp phân loại cổ điển là phương pháp dựa trên các đặc điểm hình dạng bên ngoài và các đặc điểm sinh lý của vi sinh vật để phân loại, cụ thể:
- Các đặc điểm về hình thái: hình dạng, kích thước, màu sắc của khuẩn lạc; hình dạng, kích cỡ của tế bào vi sinh vật; các đặc điểm vi cấu trúc, có tiên mao, không có tiêm mao, số lượng các tiên mao, cách thức chuyển động của tế bào…
- Các đặc điểm về sinh lí và trao đổi chất như: nguồn C, N sử dụng, nguồn năng lượng và cơ chế chuyển hóa năng lượng, các sản phẩm lên men, các sản phẩm trao đổi thứ cấp, tính mẫn cảm với các chất ức chế và kháng sinh…
Ngoài ra, còn rất nhiều phương pháp phổ biến khác nữa như: kiểm tra các phản ứng sinh hóa của vi sinh vật với các chất phản ứng khác nhau, các phản ứng miễn dịch của các kháng nguyên là thành phần cấu tạo của tế bào như kháng nguyên O của lipopolysaccharid hay của bao nhầy thường được sử dụng để phân biệt các chủng của một loài.
1.5.2. Phương pháp phân loại bằng sinh học phân tử
Hiện nay, các phương pháp phân loại hiện đại thường dựa trên việc đánh giá mức phân tử axit nucleic. Trên cơ sở trình tự DNA, người ta có thể có nhiều các phương pháp khác nhau để tiến hành phân loại.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Từ cuối thế kỷ 20, đặc biệt là những năm 1980 trở lại đây, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử, người ta đã sử dụng một phương pháp nghiên cứu mới cho phân loại vi sinh vật đó là “phân loại học phân tử”. Phương pháp mới này có thể phát hiện, mô tả và giải thích tính đa dạng sinh học ở mức phân tử giữa các loài và trong phạm vi loài trong thời gian ngắn và có độ chính xác cao.
Trước đây, việc phân loại vi sinh vật đôi khi gặp khó khăn và thiếu chính xác. Với sự phát triển của kỹ thuật sinh học phân tử, việc phân loại ngày nay dựa chủ yếu vào nghiên cứu trên các phân tử axit nucleic (DNA, RNA). Các phương pháp này phản ánh chính xác hơn mối quan hệ về mặt tiến hóa giữa các nhóm sinh vật. Tuy nhiên, cũng không thể phủ nhận vai trò của các phương pháp phân loại dựa trên các đặc điểm bên ngoài. Do vậy, cần kết hợp cả hai phương pháp để kết quả phân loại được chính xác.
Jesus và Silvia (1999) đã tóm tắt các phương pháp phân tích và khả năng sử
dụng trong phân loại vi sinh vật (Bảng 1.3) [33].
Ngày nay, việc nghiên cứu phân tử rRNA được coi là phương pháp hữu hiệu nhất để xác định mối quan hệ trên cây tiến hóa của các vi sinh vật, vì rRNA có mặt ở tất cả các loại vi sinh vật, có chức năng xác định và là trình tự có tính bảo thủ cao, chúng chỉ khác nhau rất ít giữa các nhóm vi sinh vật. Dựa vào sự khác nhau này, người ta có thể đánh giá được mối quan hệ phát sinh chủng loại và phân loại các chủng vi sinh vật. Trong 3 loại gene rRNA của vi khuẩn (5S, 16S, 23S) thì gene 16S rRNA là phù hợp nhất cho việc nghiên cứu phân loại. Gene mã hóa cho 5S rRNA có kích thước khoảng 120 nucleotide, dễ đọc và so sánh trình tự, nhưng lại không đủ để phân biệt một cách chi tiết giữa các loài. Ngược lại, gene mã hóa 23S rRNA lại có kích thước lớn (3000 nucleotide) do đó gây khó khăn cho việc tách dòng, đọc và so sánh trình tự. Chỉ có gene 16S rRNA với kích thước khoảng 1500 nucleotide vừa đủ để phân loại chi tiết giữa các chủng vi sinh vật và cũng không gây khó khăn trong nghiên cứu. Do đó, nó được ưu tiên chọn lựa trong việc phân loại vi khuẩn. Gene mã hóa cho cấu trúc 16S rRNA đã được các nhà khoa học nghiên cứu kỹ lưỡng và họ đã thiết lập được rất nhiều các cặp mồi để nhân đoạn
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
chúng bằng kỹ thuật PCR. Đây là một thuận lợi lớn cho các nghiên cứu phân loại dựa trên gene mã hóa 16S rRNA [33].
Bảng 1.3: Một số phƣơng pháp phân loại vi sinh vật
Thành phần tế bào Phƣơng pháp phân tích Phạm vi phân loại
DNA nhiễm sắc thể
Thành phần bazơ (%G+C) Chi
Biến tính DNA: DNA Loài
Các phần DNA được cắt bằng enzyme giới hạn
Loài và dưới loài Đa hình chiều dài các đoạn giới
hạn của RNA riboxom RNA riboxom
Trình tự nucleotide
Loài, chi và trên chi Lai DNA: rRNA
Protein
Trình tự axit amin Chi và trên chi
So sánh bằng phản ứng
huyết thanh Loài và chi
Các kiểu điện di
Điện di enzyme đa vị trí Các dòng trong loài
Thành tế bào Cấu trúc peptidoglycan Loài và chi Polysacharid Axit teichoic Màng Axít béo Loài và chi Lipid phân cực Axit mycolic Isoprenoid quinonones
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
1.6. Quá trình xử lý sinh học nƣớc thải và thành phần các chất ô nhiễm điển hình trong nƣớc thải công nghiệp
1.6.1. Quá trình xử lý sinh học nước thải
Để kiểm tra khả năng xử lý của các chủng vi sinh vật đã phân lập được chúng tôi tiến hành xử lý nước thải trên quy mô 5 lít bằng phương pháp sinh học. Xử lý sinh học nước thải thực chất là lợi dụng sự sinh trưởng phát triển của các vi sinh vật để thực hiện các dạng phân hủy khác nhau. Sự phân hủy khác nhau thường kèm theo sự thoát khí dưới tác dụng của các enzim do vi khuẩn tiết ra. Muốn cho quá trình xử lý sinh học đạt kết quả cao thì cần thiết phải tạo ra môi trường, điều kiện sống và hoạt động tốt nhất cho các vi sinh vật để chúng có thể phân hủy các chất hữu cơ được nhanh chóng.
Quá trình phân hủy sinh học tại chính vị trí ô nhiễm được thực hiện bởi hai nhóm vi sinh vật, đó là nhóm vi sinh vật nuôi cấy và không nuôi cấy được, trong đó nhóm vi khuẩn nuôi cấy được chỉ chiếm 1%. Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử để phát hiện các nhóm vi sinh vật không phụ thuộc nuôi cấy tại các vị trí ô nhiễm sẽ giúp các nhà khoa học hiểu biết rõ hơn về đặc tính cũng như các cơ chế phân hủy