Để có thể sử lý nước thải bằng phương pháp sinh học thì cần thiết phải tạo được bùn hoạt tính với số lượng lớn. Chỉ khi nào có bùn hoạt tính với số lượng đủ lớn mới có thể tiến hành chạy thử trên quy mô 5 lít.
Các bước để tạo bùn hoạt tính.
Lấy tập đoàn vi sinh vật làm giàu lần thứ 3 hòa vào 1 lít dung dịch gost tiến hành sục khí liên tục. Sau 7 ngày thì ngừng sục khí, để lắng và chắt bỏ phần dung dịch nước bên trên giữ lại phần bùn hoạt tính bên dưới.
Chạy thử trên quy mô 5 lít.
Cho 5 lít nước thải được lấy từ khu công nghiệp Từ Liêm vào bình 10 lít sau đó cho phần bùn đã được hoạt hóa vào, tiến hành sục khí liên tục trong 3 ngày. Sau 3 ngày lấy mẫu nước trong bình ra kiểm tra một số chỉ tiêu của nước thải.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng phát triển trên môi trƣờng chứa PAH
Phân hủy sinh học các PAH của vi sinh vật có thể diễn ra theo hai cơ chế trao đổi chất và đồng trao đổi chất. Trên thế giới có nhiều nghiên cứu về khả năng phân hủy các PAH của các chủng vi sinh vật theo cơ chế đồng trao đổi chất. Trong trường hợp đó, bổ sung nguồn carbon thứ 2 giúp vi sinh vật sinh trưởng, phát triển tốt đồng thời tăng khả năng phân hủy PAH [21, 29, 48]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn glucose với nồng độ 0,5% cùng với 50 ppm hỗn hợp PAH để làm giàu mẫu.
Sau khi thu mẫu từ nguồn nước thải khu công nghiệp Từ Liêm, chúng tôi đã tiến hành làm giầu lượng vi sinh vật có trong nguồn nước thải bằng môi trường Gost dịch có bổ sung PAH với nồng độ 50ppm (hình 3. 1).
Hình 3.1: Mẫu làm giàu lần 3 của mẫu nƣớc thải lấy từ khu công nghiệp Từ Liêm
(A) có bổ sung glucose và PAH, (B) không bổ sung glucose
Sau 7 ngày nuôi làm giàu chúng tôi nhận thấy trên cả 2 mẫu enrich, môi trường chuyển sang mầu vàng rõ rệt, lượng sinh khối bám vào thành bình khá nhiều. Trên môi trường có bổ sung glucose lượng sinh khối nhiều hơn nhưng mầu sắc của môi trường lại không có sự thay đổi rõ rệt như trong môi trường không bổ sung glucose.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Sau đó các mẫu được pha loãng tới hạn và cấy gạt trên môi trường Gost thạch có bổ xung 50 ppm hỗn hợp PAH (có và không glucose). Sau 5 ngày trên đĩa thạch xuất hiện các khuẩn lạc có hình dạng khác nhau (hình 3.2).
A B
Hình 3.2: Tập đoàn vi sinh vật trên môi trƣờng khoáng thạch với 50 ppm PAH
sau 3 lần làm giàu: (A) có bổ sung glucose, (B) không bổ sung glucose
Tập đoàn vi sinh vật phát triển trên đĩa thạch được tách riêng và nuôi sạch từng chủng và quan sát hình thái khuẩn lạc chúng tôi đã thu được 11 chủng vi sinh vật được gọi tên BTL từ 1 đến 11 (bảng 3. 1, bảng 3. 2).
Pyrene là một trong những PAH thường được sử dụng để nghiên cứu, có cấu tạo gồm 4 vòng thơm, ít tan trong nước, tan tốt trong các dung môi hữu cơ, tương đối độc và khó phân hủy sinh học, vì vậy nếu vi sinh vật có khả năng phân hủy pyrene thì nó cũng có khả năng phân hủy các loại PAH đơn giản khác, do đó chúng tôi lựa chọn pyrene là hợp chất dùng để nghiên cứu. Khi tiến hành nuôi 11 chủng này trong môi trường có chứa 50 ppm pyrene chúng tôi nhận thấy chỉ có chủng BTL4 phát triển tốt nhất còn các chủng khác phát triển kém hơn, do đó chúng tôi lựa chọn chủng BTL4 là đối tượng để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 3.1: Chủng vi khuẩn phát triển trên môi trƣờng khoáng
có bổ sung hỗn hợp PAH
TT Chủng vi
khuẩn Đặc điểm hình thái khuẩn lạc
Khả năng phát triển trên thạch/dịch
1 BTL1 Gần tròn, hơi trong, lồi, bóng D 1,5 - 2 mm +/+
2 BTL2 Tròn, trong, mọc lan trên mặt thạch, có nhân
D1,5 - 2 mm +/+
3 BTL3 Nhỏ li ti, trong, lồi D 0,05mm ++/++
4 BTL4 Tròn, trắng, tâm đục, bóng, lồi, tiết dịch vàng
1-2mm +++/+++
5 BTL5 Tròn, đục, bóng, lồi D 2 - 2,5mm ++/++
6 BTL4 Tròn, trắng nhớt, lan trên mặt thạch D 2-3mm +/+
7 BTL7 Tròn, trắng đục, nhân nhỏ nằm chính giữa ++/++
Bảng 3.2: Chủng vi khuẩn phát triển trên môi trƣờng khoáng có bổ sung hỗn
hợp PAH và 0,5% glucose TT Chủng vi
khuẩn Đặc điểm hình thái khuẩn lạc
Khả năng phát triển trên thạch
1 BTL8 Trắng, tròn, lồi, bóng, có vòng trung tâm, hơi
nhớt, D 2,5- 4mmm ++
2 BTL9 Trong, gần tròn, D 2,5- 3 mm +
3 BTL10 Tròn, đục, nhớt, D 1,5-2mm +
4 BTL 11 Tròn, trong, có vòng tâm, hơi nhớt, D 2- 3mm ++
Chú thích: D: đường kính khuẩn lạc
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
3.2. Đặc điểm khuẩn lạc và hình thái tế bào của chủng BTL4
Sau khi phân lập được chủng đơn BTL 4 chúng tôi tiến hành nuôi trên môi trường Gost thạch có bổ sung 50 ppm pyrene, BTL 4 là khuẩn lạc có mầu trắng đục, bóng nhớt, không ăn sâu vào mặt thạch,tiết ra sắc tố mầu vàng, đường kính từ 1-2 mm. Khi quan sát bằng kính hiển vị điện tử quét có độ phóng đại 15000 lần sẽ thấy tế bào BTL 4 có hình cầu với kích thước khoảng 0,8 - 1,2 µm (hình 3. 3).
A B
Hình 3.3: (A) Hình thái khuẩn lạc và (B) hình thái tế bào chủng BTL 4
Để xác định chính xác chủng này có thuộc những chủng có khả năng phân hủy PAH không, chúng tôi tiến hành phân loại phân tử bằng cách xác định trình tự nucleotide gen 16S rRNA của chủng BTL 4.
3.3. Xác định trình tự đoạn gen mã hóa 16S rRNA của chủng vi khuẩn BTL4
Hiện nay, phương pháp xác định trình tự gen mã hóa 16S rRNA được xem là một trong những phương pháp hữu hiệu trong việc phân loại, định tên, xác định mối quan hệ trên cây tiến hóa của các chủng vi khuẩn. Trình tự đoạn gen mã hóa 16S rRNA của chủng vi khuẩn BTL4 được chúng tôi tiến hành các bước nghiên bao gồm.
3.3.1. Tách chiết DNA tổng số và nhân đoạn gen 16S rRNA của chủng BTL4
Tách chiết và làm sạch DNA tổng số vi khuẩn là khâu quan trọng vì chất lượng của DNA sẽ ảnh hưởng đến hiệu quả của các thí nghiệm tiếp theo. DNA tổng số của chủng vi khuẩn BTL4 được tách chiết theo mô tả của Sambrook và Russell (2001) [49]
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
DNA tổng số sau khi tách được điện di kiểm tra trên gel agarose 1%, phổ điện di thu được thể hiện trên (hình 3. 4).
A B
Hình 3.4: Điện di đồ DNA tổng số chủng BTL4 (A), và kiểm tra nhân đoạn gen
16S rRNA bằng kỹ thuật PCR (B)
Quan sát kết quả điện di chúng tôi thấy DNA tách được có độ tinh sạch cao, hàm lượng lớn, băng gọn không bị đứt gãy nhiều, đủ điều kiện cho các thí nghiệm tiếp theo, do đó chúng tôi sử dụng DNA tổng số làm khuôn, cặp mồi đặc hiệu 27F, 1525 R để tiến hành nhân đoạn gen 16S rRNA bằng phương pháp PCR. Sản phẩm sau khi PCR được điện di trên agarose. Kết quả điện di được thể hiện ở hình 3. 4 (B). Sau khi điện di kiểm tra nhận thấy đoạn gen 16S rRNA có kích thước khoảng 1500 bp và phù hợp với tính toán, chúng tôi đã tiến hành làm sạch bằng bộ kit AccuPrep PCR Purification của nhà sản xuất Bioneer. Sản phẩm PCR sau khi tinh
sạch được gắn vào vector tách dòng pBT và biến nạp vào tế bào khả biến E. coli
DH5α.
3.3.2. Tách dòng gen 16S rRNA của chủng BTL4
Trình tự tách dòng gen 16S rRNA được thực hiện theo các bước:
Gắn sản phẩm PCR vào vector pBT và biến nạp vào tế bào E.coli DH5α.
Sản phẩm PCR nhân đoạn gen 16S rRNA được gắn vào vector pBT nhờ
enzyme T4 ligase và biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α.
1: Marker 1kb 2: Sản phẩm PCR
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Sau khi nuôi ở 370C trong 18 giờ trên môi trường LB đặc có chứa Carbe, X-
gal và IPTG đã xuất hiện những khuẩn lạc trắng xen kẽ những khuẩn lạc xanh (hình 3.5 (A)). Khuẩn lạc trắng là khuẩn lạc có thể mang DNA plasmid đã được gắn sản phẩm PCR nhân đoạn gen 16S rRNA, khuẩn lạc xanh là khuẩn lạc không đính đoạn DNA ngoại lai. Số lượng khuẩn lạc trắng nhiều hơn khuẩn lạc xanh chứng tỏ hiệu suất biến nạp là khá tốt.
A B
Hình 3.5: Kết quả biến nạp chủng BTL4(A), và điện di đồ DNA plasmid của
dòng số 2 từ BTL4 trên gel agarose 1% plasmid của chủng lạc mầu xanh (B)
Các khuẩn lạc trắng có thể mang vector chứa đoạn DNA cần thiết. Tuy nhiên, để kiểm tra lại một cách chắc chắn xem có phải khuẩn lạc trắng đó có mang đoạn gen cần thiết đã được gắn vào hay không chúng tôi tiến hành tách DNA plasmid và
điện di sản phẩm DNA plasmid được cắt bằng enzyme BamHI
* Tách DNA plasmid và kiểm tra các dòng khuẩn lạc thích hợp
Các khuẩn lạc lựa chọn được nuôi trong môi trường LB dịch để tách DNA plasmid theo Kit Bioneer. Sản phẩm DNA plasmid được điện di trên gel agarose 1% để lựa chọn dòng tế bào mang vector tái tổ hợp.
Kết quả điện di cho thấy trong 3 dòng khuẩn lạc được chọn thì chỉ có DNA plasmid của dòng số 2 nằm ở vị trí cao hơn mẫu đối chứng (DNA plasmid của khuẩn lạc xanh) (hình 3.5 (B)). Như vậy, dòng khuẩn lạc số 2 này có thể mang
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
vector tái tổ hợp chứa đoạn gen 16S rRNA nhân lên từ DNA tổng số của vi khuẩn BTL4. Do đó để kiểm tra xem liệu thực sự DNA plasmid của dòng số 2 có mang
sản phẩm mong muốn hay không chúng tôi đã dùng enzyme BamHI để cắt sản
phẩm DNA plasmid của dòng khuẩn lạc số 2. Sản phẩm cắt DNA plasmid sau đó được điện di trên gel agarose 1% (hình 3.6).
Hình 3.6: Sản phẩm cắt DNA plasmid của dòng số 2 từ BTL4
Trên hình 3.6 chúng tôi nhận thấy, sản phẩm cắt DNA plasmid của dòng số 2 đã xuất hiện một băng có kích thước khoảng 1500 bp, tương tự như kích thước của đoạn DNA ngoại lai đã được biến nạp. Như vậy, dòng plasmid số 2 có thể đã được gắn đoạn DNA mong muốn. Sau đó, DNA plasmid của dòng số 2 được tách và tinh sạch để xác định trình tự.
3.3.3 Trình tự đoạn gen mã hóa 16S rRNA của chủng BTL4
Trình tự đoạn gen mã hóa 16S rRNA của chủng BTL4 đã được xác định trên máy đọc trình tự tự động ABI PRISM 3100. Sau khi phân tích và xử lý số liệu, chúng tôi thu được trình tự đoạn gen16S rRNA được trình bày trên hình 3.7
M 1 1,5 Kb M: Thang DNA chuẩn kích thước 1kb 1: Sản phẩm cắt DNA plasmid của dòng số 2
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
1 cgggtgagta acgcgtggga atatgccctt tggtacggaa tagtcctggg aaactggggg 61 taataccgta tgcgcccttc gggggaaaga tttatcgcca aaggattagc ccgcgttgga 121 ttaggtagtt ggtggggtaa tggcctacca agccgacgat ccatagctgg tttgagagga 181 tgatcagcca cactgggact gagacacggc ccagactcct acgggaggca gcagtgggga 241 atcttagaca atgggggcaa ccctgatcta gccatgccgc gtgagtgatg aaggccctag 301 ggttgtaaag ctctttcagc tgggaagata atgacggtac cagcagaaga agccccggct 361 aactccgtgc cagcagccgc ggtaatacgg agggggctag cgttgttcgg aattactggg 421 cgtaaagcgc acgtaggcgg accggaaagt tgggggtgaa atcccggggc tcaaccccgg 481 aactgccttc aaaactatcg gtctggagtt cgagagaggt gagtggaatt ccgagtgtag 541 aggtgaaatt cgtagatatt cggaggaaca ccagtggcga aggcggctca ctggctcgat 601 actgacgctg aggtgcgaaa gcgtggggag caaacaggat tagataccct ggtagtccac 661 gccgtaaacg atgaatgcca gtcgtcgggc agcatgctgt tcggtgacac acctaacgga 721 ttaagcattc cgcctgggga gtacggtcgc aagattaaaa ctcaaaggaa ttgacggggg 781 cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgcagaac cttaccaacc 841 cttgacatcc caggaccggc ccggagacgg gtctttcact tcggtgacct ggagacaggt 901 gctgcatggc tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgtttcg gttaagtccg gcaacgagcg 961 caacccacac ttccagttgc catcatttgg ttgggcactc tggaagaact gccgatgata 1021 agtcggagga aggtgtggat gacgtcaagt cctcatgggc ccttacgggt tgggctacac 1081 acgtgctaca atggtggttg acaggtgggg ttattcccaa aaggcatctc agttcggatt 1141 ggggtcttgc actcgaccca tgagttggat ccgctagtta ttcgcggaac agcatgcgcg 1201 ggtgattacg tttcctgggc ttgttacaca ccgccggtca cacatgggga gttgggttct 1261 accgacggcg tgcgcttaca gcatgggggc agcggaccgg tagg
Hình 3.7: Kết quả giải trình tự đoạn gen 16S rRNA của chủng BTL4
Dựa vào việc so sánh trình tự đoạn gen 16S rRNA của chủng vi khuẩn BTL4 với trình tự các chủng vi sinh vật prokaryote chuẩn khác trên LPSN (List of Prokaryotic names with Standing in Nomenclature), chúng tôi đã thống kê mức độ tương đồng của các chủng so sánh (bảng 3. 3) và xây dựng cây phát sinh chủng loại của chủng vi khuẩn này (hình 3. 8).
Từ bảng so sánh trình tự đoạn gen 16S rRNA chúng tôi nhận thấy chủng
BTL4 có quan hệ gần với các chung thuộc chi Paracoccus. Dựa trên việc so sánh
nucleotide nhận thấy chủng BTL4 có quan hệ gần gũi với chủng Paracoccus chúng
tôi đặt tên chủng này là Paracoccus sp. BTL4. Chủng vi khuẩn này được đăng ký
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 3.3: Mức độ tƣơng đồng của BTL4 so với một số chủng vi khuẩn
TT Tên chủng vi khuẩn Mã số trên NCBI Mức độ tƣơng đồng
1 Paracoccus alcaliphilus AY01417 93%
2 Paracoccus aminophilus AY01417 93%
3 Paracoccus aminovorans D32240 94%
4 Paracoccus bengalensis AJ864469 97%
5 Paracoccus carotinifaciens AB006899 91%
6 Paracoccus denitrificans Y16927 95%
7 Paracoccus sp. 22-5 GQ260189 93%
8 Paracoccus versutus AY014174 97%
9 Paracoccus halophilus DQ423482 94%
Hình 3.8: Cây phát sinh chủng loại của chủng BTL4
Paracoccus versutus(AY 014174)
Paracoccus bengalensis (AJ 864469)
Paracoccus. sp.BTL4 (AB646256)
Paracoccus versutus (DQ423482)
Paracoccus denitrificans (Y 16927)
Paracoccus aminophilus (AY 014176)
Paracoccus aminovorans (D 32240)
Paracoccus carotinifaciens (AB006899)
Paracoccus sp. 22-5 (GQ 260189)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Trên thế giới một số nghiên cứu về khả năng phân hủy PAH của chi
Paracoccus đã được công. Theo nghiên cứu của Jian và các cộng sự vào năm 2009
chủng Paracoccus aminovorans HPD-2 được phân lập từ trong đất nhiễm PAHs,
sau 14 ngày nuôi cấycó khả năng phân hủy 36% PAH có 3 vòng thơm, 26% PAH
có 5 vòng thơm [31]. Còn theo nghiên cứu đã được công bố vào năm 2010 của Teng
Y và các cộng sự về khả năng phân hủy PAH của Paracoccus sp. strain HPD-2
được phân lập từ đất thì chúng có khả năng phân hủy 30,7% PAH 3 vòng thơm, 24,3% PAH 5, 6 vòng thơm [41].
Như vậy, cùng với các chủng vi sinh vật khác chủng Paracoccus. sp BTL4 mà
chúng tôi phân lập được đã góp phần làm phong phú thêm số lượng các chủng vi
khuẩn thuộc chi Paracoccus nói riêng và hệ vi sinh vật có khả năng phân hủy PAH
trong nước thải công nghiệp nói chung, phục vụ cho công nghệ phân hủy sinh học nguồn nước thải sau này. Để xác định hiệu quả phân hủy pyrene của chủng vi khuẩn này trước hết chúng tôi tiến hành xác định các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát sinh trưởng phát triển của chúng.
3.4. Ảnh hƣởng của nhiệt độ, pH đến sự phát triển của chủng BTL4
Việc phân lập và định tên một số chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy PAH trong nước thải nhằm mục đích xác định các điều kiện tối ưu để vi sinh vật đó phát triển, từ đó có thể kiểm soát quá trình phát triển của sinh vật theo mong muốn. Các yếu tố ảnh hướng lớn nhất, trực tiếp nhất đến sự sinh trưởng, phát triển, cũng như khả năng phân hủy PAH của vi sinh vật là nhiệt độ và pH, đồng thời đây cũng là 2 nhân tố dễ kiểm soát nhất. Do đó chúng tôi tiến hành thí nghiệm kiểm tra sự ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến sự phát triển của chủng BTL4.
3.4.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Chủng BTL4 được nuôi cấy trong môi trường Gost dịch có bổ sung 100 ppm
pyrene ở 300
C và 370C trong 6 ngày. Cứ 24h chúng tôi lấy 1ml dung dịch nuôi và
kiểm tra mật độ quang phổ tại bước sóng 620 nm. Kết quả thu được thể hiện trên hình 3.9.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.9: Đồ thị thể hiện sự phát triển của chủng BTL4 ở 300C và 370C