Hiện nay, các phương pháp phân loại hiện đại thường dựa trên việc đánh giá mức phân tử axit nucleic. Trên cơ sở trình tự DNA, người ta có thể có nhiều các phương pháp khác nhau để tiến hành phân loại.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Từ cuối thế kỷ 20, đặc biệt là những năm 1980 trở lại đây, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử, người ta đã sử dụng một phương pháp nghiên cứu mới cho phân loại vi sinh vật đó là “phân loại học phân tử”. Phương pháp mới này có thể phát hiện, mô tả và giải thích tính đa dạng sinh học ở mức phân tử giữa các loài và trong phạm vi loài trong thời gian ngắn và có độ chính xác cao.
Trước đây, việc phân loại vi sinh vật đôi khi gặp khó khăn và thiếu chính xác. Với sự phát triển của kỹ thuật sinh học phân tử, việc phân loại ngày nay dựa chủ yếu vào nghiên cứu trên các phân tử axit nucleic (DNA, RNA). Các phương pháp này phản ánh chính xác hơn mối quan hệ về mặt tiến hóa giữa các nhóm sinh vật. Tuy nhiên, cũng không thể phủ nhận vai trò của các phương pháp phân loại dựa trên các đặc điểm bên ngoài. Do vậy, cần kết hợp cả hai phương pháp để kết quả phân loại được chính xác.
Jesus và Silvia (1999) đã tóm tắt các phương pháp phân tích và khả năng sử
dụng trong phân loại vi sinh vật (Bảng 1.3) [33].
Ngày nay, việc nghiên cứu phân tử rRNA được coi là phương pháp hữu hiệu nhất để xác định mối quan hệ trên cây tiến hóa của các vi sinh vật, vì rRNA có mặt ở tất cả các loại vi sinh vật, có chức năng xác định và là trình tự có tính bảo thủ cao, chúng chỉ khác nhau rất ít giữa các nhóm vi sinh vật. Dựa vào sự khác nhau này, người ta có thể đánh giá được mối quan hệ phát sinh chủng loại và phân loại các chủng vi sinh vật. Trong 3 loại gene rRNA của vi khuẩn (5S, 16S, 23S) thì gene 16S rRNA là phù hợp nhất cho việc nghiên cứu phân loại. Gene mã hóa cho 5S rRNA có kích thước khoảng 120 nucleotide, dễ đọc và so sánh trình tự, nhưng lại không đủ để phân biệt một cách chi tiết giữa các loài. Ngược lại, gene mã hóa 23S rRNA lại có kích thước lớn (3000 nucleotide) do đó gây khó khăn cho việc tách dòng, đọc và so sánh trình tự. Chỉ có gene 16S rRNA với kích thước khoảng 1500 nucleotide vừa đủ để phân loại chi tiết giữa các chủng vi sinh vật và cũng không gây khó khăn trong nghiên cứu. Do đó, nó được ưu tiên chọn lựa trong việc phân loại vi khuẩn. Gene mã hóa cho cấu trúc 16S rRNA đã được các nhà khoa học nghiên cứu kỹ lưỡng và họ đã thiết lập được rất nhiều các cặp mồi để nhân đoạn
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
chúng bằng kỹ thuật PCR. Đây là một thuận lợi lớn cho các nghiên cứu phân loại dựa trên gene mã hóa 16S rRNA [33].
Bảng 1.3: Một số phƣơng pháp phân loại vi sinh vật
Thành phần tế bào Phƣơng pháp phân tích Phạm vi phân loại
DNA nhiễm sắc thể
Thành phần bazơ (%G+C) Chi
Biến tính DNA: DNA Loài
Các phần DNA được cắt bằng enzyme giới hạn
Loài và dưới loài Đa hình chiều dài các đoạn giới
hạn của RNA riboxom RNA riboxom
Trình tự nucleotide
Loài, chi và trên chi Lai DNA: rRNA
Protein
Trình tự axit amin Chi và trên chi
So sánh bằng phản ứng
huyết thanh Loài và chi
Các kiểu điện di
Điện di enzyme đa vị trí Các dòng trong loài
Thành tế bào Cấu trúc peptidoglycan Loài và chi Polysacharid Axit teichoic Màng Axít béo Loài và chi Lipid phân cực Axit mycolic Isoprenoid quinonones
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
1.6. Quá trình xử lý sinh học nƣớc thải và thành phần các chất ô nhiễm điển hình trong nƣớc thải công nghiệp
1.6.1. Quá trình xử lý sinh học nước thải
Để kiểm tra khả năng xử lý của các chủng vi sinh vật đã phân lập được chúng tôi tiến hành xử lý nước thải trên quy mô 5 lít bằng phương pháp sinh học. Xử lý sinh học nước thải thực chất là lợi dụng sự sinh trưởng phát triển của các vi sinh vật để thực hiện các dạng phân hủy khác nhau. Sự phân hủy khác nhau thường kèm theo sự thoát khí dưới tác dụng của các enzim do vi khuẩn tiết ra. Muốn cho quá trình xử lý sinh học đạt kết quả cao thì cần thiết phải tạo ra môi trường, điều kiện sống và hoạt động tốt nhất cho các vi sinh vật để chúng có thể phân hủy các chất hữu cơ được nhanh chóng.
Quá trình phân hủy sinh học tại chính vị trí ô nhiễm được thực hiện bởi hai nhóm vi sinh vật, đó là nhóm vi sinh vật nuôi cấy và không nuôi cấy được, trong đó nhóm vi khuẩn nuôi cấy được chỉ chiếm 1%. Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử để phát hiện các nhóm vi sinh vật không phụ thuộc nuôi cấy tại các vị trí ô nhiễm sẽ giúp các nhà khoa học hiểu biết rõ hơn về đặc tính cũng như các cơ chế phân hủy sinh học của những nhóm vi sinh vật để từ đó áp dụng cả hai phương pháp trong phân hủy sinh học là làm giàu và kích thích tập đoàn vi sinh vật bản địa làm tăng hiệu suất xử lý.
Trong quá trình xử lý nước thải, dựa vào nguồn nước và nồng độ chất ô nhiễm, các nhà khoa học sẽ lựa chọn các phương pháp xử lý khác nhau. Đối với nước thải ô nhiễm các hợp chất vòng thơm, phương pháp xử lý hiếu khí là một lựa chọn tối ưu. Xử lý nước thải bằng phương pháp hiếu khí nhân tạo dựa trên nhu cầu oxy cần cung cấp cho vi sinh vật hiếu khí có trong nước thải hoạt động và phát triển. Quá trình này của vi sinh vật được gọi chung là hoạt động sống, gồm hai quá trình: dinh dưỡng sử dụng các chất hữu cơ, các nguồn nito và phospho cùng những ion kim loại khác với mức độ vi lượng để xây dựng tế bào mới, phát triển tăng sinh
khối, phục vụ cho sinh sản; phân hủy các chất hữu cơ còn lại thành CO2 và nước.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
trình dinh dưỡng và oxi hóa của vi sinh vật có trong nước thải đều cần oxi. Để đáp ứng được nhu cầu oxi này người ta thường phải khuấy đảo khối nước để oxi từ không khí được khuếch tán và hòa tan vào nước. Tuy nhiên, biện pháp này chưa thể đáp ứng được nhu cầu oxi. Do vậy, người ta sử dụng các biện pháp hiếu khí tích cực hơn như thổi khí kết hợp với khuấy đảo. Các biện pháp này thường được sử dụng trong các công trình xử lý nước thải bằng phương pháp hiếu khí nhân tạo như: các bể phản ứng sinh học hiếu khí, các bể lọc sinh học Biofilter, các loại đĩa quay sinh học (RBC) v.v… Đối với nguồn nước thải ô nhiễm với hàm lượng COD trên dưới 1000 mg/l và hàm lượng BOD5 trên dưới 400 mg/l thì bể xử lý hiếu Aeroten là một phương pháp phổ biến.
Nước thải sau khi được xử lý sơ bộ loại bỏ rác và dầu mỡ còn chứa phần lớn các chất hữu cơ ở dạng hòa tan cùng các chất lơ lửng đi vào aeroten. Các chất lơ lửng này là một số chất rắn và có thể cùng các chất hữu cơ chưa phải là dạng hòa tan. Các chất lơ lửng này làm nơi vi khuẩn bám vào và để cư trú, sinh sản và phát triển, dần dần thành các hạt cặn bong. Các hạt này dần dần to và lơ lửng trong nước của quần thể vi sinh vật. Các hạt bông cặn này cũng chính là bùn hoạt tính. Bùn hoạt tính là các bông cặn có màu nâu sẫm, chứa các chất hữu cơ hấp phụ từ nước thải và là nơi cư trú cho các vi khuẩn cùng các sinh vật bậc thấp khác, như nguyên sinh động vật sống và phát triển. Trong nước thải có những hợp chất hữu cơ hòa tan- loại hợp chất dễ bị vi sinh vật phân hủy nhất. Ngoài ra, còn có các loại hợp chất hữu cơ khó bị phân hủy hoặc loại hợp chất chưa hòa tan, khó hòa tan ở dạng keo - các dạng hợp chất này có cấu trúc phức tạp cần được vi khuẩn tiết ra enzyme ngoại bào phân hủy thành những chất đơn giản hơn rồi sẽ thẩm thấu qua màng tế bào và bị oxi hóa tiếp thành sản phẩm cung cấp vật liệu cho tế bào hoặc sản phẩm cuối cùng là CO2 và nước.
Quá trình oxi hóa các chất bẩn hữu cơ xảy ra trong bể aeroten qua ba giai đoạn: - Giai đoạn 1: Tốc độ oxi hóa bằng tốc độ tiêu thụ oxi. Ở giai đoạn này bùn hoạt tính hình thành và phát triển. Hàm lượng oxi cần cho vi sinh vật sinh trưởng, đặc biệt ở thời gian đầu tiên nguồn dinh dưỡng trong nước thải rất phong phú,
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
lượng sinh khối trong thời gian này rất ít. Sau khi vi sinh vật thích nghi với môi trường, chúng sinh trưởng rất mạnh theo cấp số nhân. Vì vậy, lượng oxi tiêu thụ tăng cao dần.
- Giai đoạn 2: Vi sinh vật phát triển ổn định và tốc độ tiêu thụ oxi cũng ở mức gần như ít thay đổi. Chính ở giai đoạn này các chất bẩn hữu cơ bị phân hủy nhiều nhất.
- Giai đoạn 3: Sau một thời gian khá dài, tốc độ oxi hóa cầm chừng và có chiều hướng giảm, tốc độ tiêu thụ oxi tăng lên. Đây là giai đoạn nitrat hóa các muối amoni.
Sau cùng, nhu cầu oxi lại giảm và cần phải kết khúc quá trình làm việc của bể aeroten. Sau khi oxi hóa được 80 - 95% BOD trong nước thải, nếu không khuấy đảo hoặc thổi khí, bùn hoạt tính sẽ lắng xuống đáy, cần phải lấy bùn cặn ra khỏi nước để tránh hiện tượng ô nhiễm thứ cấp, nghĩa là sinh khối vi sinh vật trong bùn (chiếm 70% khối lượng cặn bùn) sẽ bị tự phân. Tế bào vi khuẩn có hàm lượng protein rất cao (60 - 80% so với chất khô), ngoài ra còn có các hợp chất chứa chất béo, hydratcarbon, các chất khoáng, v.v… khi bị tự phân sẽ làm ô nhiễm nguồn nước.
1.6.2. Thành phần các chất ô nhiễm điển hình trong nước thải công nghiệp
Tính chất của nước thải khu công nghiệp rất đa dạng do thành phân và nồng độ các chất ô nhiễm rất khác nhau. Nước thải từ các loại hình công nghiệp như hóa dầu, chế biến thực phẩm, bia, rượu, hóa chất...thường có hàm lượng các chất hữu cơ BOD, COD, TSS, dầu và mỡ, kim loại nặng, PAH, hợp chất dễ bay hơi, chất hữu cơ khó phân hủy cao... độ pH, mùi và các hợp chất sunfua thường biến đổi. Nước thải của các nhà máy hóa chất thường có nhiều các hợp chất độc hại như thuốc trừ sâu, PAH, phenol... [11].
BOD5 - là thông số biểu thị nhu cầu oxi sinh hóa trong 5 ngày, đặc trưng bởi
lượng oxi cần thiết cho các vi khuẩn oxi hóa sinh hóa các chất hữu cơ dễ phân hủy sinh học có trong một đơn vị thể tích nước thải trong thời gian 5 ngày ở điều kiện
200C. BOD5 được biểu thị bằng đơn vị mg/L, và được sử dụng phổ biến như một
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
hữu cơ dễ bị oxi hóa sinh hóa trong nước thải. Theo tiêu chuẩn Việt Nam về chỉ số
BOD5 trong nước thải của các khu công nghiệp là 50mg/L.
COD - là nhu cầu oxi hóa học đặc trưng cho lượng oxy cần thiết (tính bằng mg/L) để oxi hóa hóa học các hợp chất hữu cơ có trong nước thải bằng dichromat (chất oxy hóa mạnh trong môi trường axit. Thực tế cho thấy, một trong những ưu điểm của việc ứng dụng thông số này là thí nghiệm đo COD có thể tiến hành nhanh
trong khoảng thời gian 2,5h (ở 1400
C).
BOD∞ thông số đặc trưng cho tổng lượng oxy hòa tan trong nước thải, cần
thiết để vi khuẩn thực hiện quá trình oxi hóa sinh hóa các hợp chát hữu cơ dễ phân hủy sinh học tính cho một đơn vị thể tích nước thải, cho đến khi quá trình hô hấp kết thúc. Nó thể hiện tổng lượng chất hữu cơ có thể phân hủy sinh học trong nước thải.
BOD∞/COD - thể hiện khả năng phân hủy sinh học của các chất hữu cơ trong
mẫu nước thải(hay khả năng ứng dụng phương pháp sinh học trong xử lý nước thải). Khi tỷ lệ này giảm, có nghĩa là hàm lượng các hợp chất hữu cơ khó phân hủy sinh học tăng lên trong mẫu nước thải (ví dụ: xenluloza, linhin, tanin...).
Dầu, mỡ thường xuất hiện nhiều trong nước thải, bao gồm các chất béo, các loại dầu, các chất sáp và các chất tương tự khác. Trong nước thải công nghiệp trước khi xử lý thì lượng dầu mỡ thường là 200- 3000mg/L tùy vào ngành công nghiệp, tuy nhiên theo tiêu chuẩn Việt Nam về chỉ số dầu mỡ trong nước thải của các khu công nghiệp là 20mg/L.
Tổng lượng photpho là thông số đại diện cho tất cả các dạng photpho vô cơ và hữu cơ tồn tại trong nước thải, trong nước thải công nghiệp thì tổng lượng photpho đạt tiêu chuẩn khi <6 mg/L.
Tổng lượng nito thông số đại diện cho tất cả các dạng tồn tại của nito trong
nước bao gồm hàm lượng NH4+, nito hữu cơ, NO3-... khi tổng lượng nito trong nước
thải công nghiệp nhỏ hơn 30 mg/L thì đạt tiêu chuẩn Việt Nam về lượng nito trong nước thải.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Chƣơng 2
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.1. Nguyên liệu, hóa chất và các thiết bị sử dụng
2.1.1. Nguyên liệu
Mẫu nước thải được lấy ở bể chứa của khu Công nghiệp vừa và nhỏ Từ Liêm (Hà Nội) ở các vị trí khác nhau, được trộn đều và lưu trữ ở phòng Công nghệ sinh học môi trường, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và công nghệ Việt Nam trong vòng 24 giờ để phân tích.
2.1.2. Hóa chất, môi trường
* Hóa chất
Các hóa chất sử dụng đều là hóa chất ngoại nhập của các hãng Sigma, Merk, Fermantas, Biobasic…
* Môi trường nuôi cấy
- Môi trường khoáng Gost dịch (g/l):
KNO3 : 3 g KH2PO4 : 0.3 g MgSO4 : 0.4 g NaH2PO4 : 0.4 g NaCl : 1 g Chỉnh pH 7
Nước máy vừa đủ 1 lít
- Môi trường khoáng Gost thạch
Công thức các hóa chất giống môi trường khoáng dịch nhưng có thêm từ 18- 20 g agar, nước máy đủ đến 1 lít.
- Nước muối sinh lý (0.85%)
NaCl : 8.5 g
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Môi trường hiếu khí tổng số dịch (g/l):
Pepton : 5g Cao thịt : 3g Glucose : 1g NaCl : 1g Nước cất : tới 1lít Chỉnh pH 7 - 7,2
- Môi trường hiếu khí tổng số thạch (g/l)
Công thức các hóa chất giống môi trường hiếu khí tổng số dịch nhưng có thêm từ 18-20 g agar, nước cất đủ đến 1 lít. - Môi trường LB dịch: NaCl : 10g Tryptone : 10g Cao men : 5g Chỉnh pH 7,0 - 7,2 Nước cất vừa đủ 1 lít. - Môi trường LB thạch:
Công thức hóa chất giống môi trường LB dịch nhưng có thêm 18-20g agar, nước cất vừa đủ 1 lít.
Các môi trường được cân cẩn thận và được khử trùng ở 1210
C trong 30 phút.
2.1.3. Thiết bị
Trong quá trình nghiên cứu, các thiết bị, máy móc đã được sử dụng có độ chính xác cao tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học môi trường và phòng thí nghiệm trọng điểm Quốc gia về công nghệ Gene - Viện Công nghệ sinh học bao