2.2.5.1. Tách chiết DNA tổng số của vi khuẩn.
Bước 1: Thu sinh khối tế bào bằng cách lấy dịch nuôi cấy chuyển vào ống li
tâm rồi li tâm với vận tốc 6.000 vòng/phút ở 4o
C trong 10 phút.
Bước 2: Hòa tan mẫu trong 400 µl đệm lysis rồi lắc kỹ cho tan tủa.
Bước 3: Bổ sung 50 µl lysozym và ủ ở 37o
C trong 30 phút.
Bước 4: Bổ sung 20 µl protease K rồi ủ ở 56oC trong 2 giờ.
Bước 5: Bổ sung phenol (tỷ lệ 1:1 v/v), lắc đều và ly tâm 12.000 vòng/phút
trong 15 phút ở 4o
C.
Bước 6: Hút pha trên chuyển sang eppendorf mới, bổ sung CI (24:1) với tỷ lệ
1:1 v/v, lắc nhẹ sau đó ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4o
C.
Bước 7: Hút pha trên chuyển sang eppendorf mới và tủa DNA bằng cồn tuyệt
đối, giữ ở -20oC trong khoảng 2-3 giờ.
Bước 8: Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4oC, thu tủa DNA.
Bước 9: Rửa tủa bằng cồn 70 %, ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4o
C Bước 10: Làm khô tủa và hòa tan tủa trong nước khử ion vô trùng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.2.5.2. Nhân đoạn gene 16S rRNA bằng kỹ thuật PCR
Nguyên tắc:
Taq polymerase là một loại enzyme DNA-polymerase được tách từ vi khuẩn
suối nước nóng Thermus aquaticus, có khả năng tổng hợp DNA in vitro khi có đầy
đủ các yếu tố: DNA khuôn, 4 loại deoxynucleotide (A, T, G, C) và cặp mồi chuyên biệt. Mồi là những đoạn DNA ngắn có khả năng bắt cặp với một đầu của mạch DNA khuôn, DNA-polymerase sẽ kéo dài để hình thành đoạn DNA mới. Các đoạn DNA mới lại được sử dụng làm khuôn. DNA được nhân lên theo cấp số nhân, sau nhiều chu kỳ (khoảng 25-35 chu kỳ), lượng DNA được khuếch đại lên hàng triệu lần.
Cặp mồi 27F, 1525R được sử dụng để nhân đoạn gene từ DNA tổng số của chủng BTL4 có trình tự như sau: 27F: 5'- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3'. 1525R: 5'- AAAGGAGGTGATCCAGCC -3' Thành phần phản ứng: Buffer Taq (10X) : 2,5µl MgCl2 (25 mM) : 3µl dNTPs (2,5 mM) : 2,5µl Mồi xuôi (20 µM) : 1µl Mồi ngược (20 µM) : 1µl
Taq DNA polymerase (5 U/µl) : 0,2µl
dH2O : 13,8µl
DNA khuôn : 1µl
Tổng thể tích : 25µl
Chu trình nhiệt được sử dụng để nhân đoạn gene16S rRNA của chủng vi khuẩn BTL4 như sau:
Bước 1 : 95°C trong 5 phút Bước 2 : 95°C trong 1 phút
Bước 3 : 55°C (58°C) trong 1 phút Bước 4 : 72°C trong 3 phút
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bước 5 : lặp lại 35 chu kỳ từ bước 2 đến bước 4 Bước 6 : 72°C trong 10 phút
Bước 7 : 4°C để bảo quản.
Sản phẩm PCR được làm sạch bằng bộ kit AccuPrep PCR Purification theo quy trình của nhà sản xuất. Cụ thể là:
Bước 1: Thêm 100µl Binding buffer vào các ống Eppendorf chứa mẫu vừa thực hiện phản ứng PCR, Votex nhẹ.
Bước 2: Hút hết sản phẩm trên sang các ống Eppendorf có bổ sung cột lọc. Bước 3: Ly tâm 13000 vòng/phút/40C. Đổ dịch lỏng, thu cặn bám trên cột lọc. Bước 4: Thêm 500µl Washing buffer vào các ống Eppendorf. Ly tâm 13000 vòng/phút/40C. Đổ dịch thu cặn bám trên cột lọc.
Bước 5: Lặp lại bước 4 trên thêm 1 lần nữa
Bước 6: Ly tâm 13000 vòng/phút/40C thêm một lần nữa cho khô.
Bước 7: Thêm 17µl nước deion vào và đợi từ 1-2 phút. Ly tâm 13000 vòng/phút/40C ta được sản phẩm PCR đã tinh sạch.
2.2.5.3 Tách dòng đoạn gene mã hóa 16S rRNA vào vector pBT
Hiện nay, có 2 phương pháp để xác định trình tự đoạn gene 16S rRNA. Một là, sản phẩm PCR sau khi tinh sạch được gắn vào vector tách dòng (plasmid), sau đó biến nạp vào tế bào khả biến E.coli, sau khi kiểm tra chính xác đoạn gene mong muốn được gắn vào plasmid thì đoạn gene đó được tách ra khỏi plasmid, tinh sạch và xác định trình tự dựa vào cặp mồi M13 trên vector tách dòng; hai là, giải trình tự trực tiếp từ sản phẩm PCR sau khi đã tinh sạch với cặp mồi như đã dùng nhân đoạn gene đó từ DNA tổng số. Phương pháp thứ nhất thường được sử dụng với các đoạn gene với kích thước lớn trên 1000 bp (đối với chủng BTL6) hoặc các gene chức năng, còn phương pháp thứ hai có thể được sử dụng với các đoạn gene có kích thước dưới 1000 bp (đối với chủng BTL11).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
* Quy trình gắn đoạn gene mong muốn vào vector pBT Nguyên tắc:
Đoạn DNA cần thiết nhân lên trong phản ứng PCR được lựa chọn ở trên được gắn vào vector pBT tạo thành vector tái tổ hợp mang đoạn gene 16S rRNA.
Thành phần phản ứng: Dung dịch đệm : 1,0 µl
Vector pBT : 1,0 µl
Sản phẩm PCR (đoạn DNA cần thiết) : 2,0 µl
Enzyme T4 ligase : 1,0 µl
ddH2O : 5,0 µl
Tổng thể tích : 10 µl
Phản ứng gắn đoạn DNA cần thiết được thực hiện trong điều kiện 22ºC trong thời gian 1 giờ. Sau đó sản phẩm được biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α.
* Quy trình biến nạp
Bước 1: Lấy 4µl vector tái tổ hợp ở trên cho vào ống đựng tế bào khả biến Ecoli DH5α, mix nhẹ rồi ủ trong đá 30 phút.
Bước 2: Sốc nhiệt ở 42ºC trong 1 phút 30 giây. Bước 3: Đặt ống tế bào trong đá 2 phút.
Bước 4: Thêm 150µl LB lỏng vào trong ống đựng tế bào rồi đem nuôi ở tủ lắc 370C từ 1 - 2 giờ.
Bước 5: Hút 100µl dịch nuôi gạt trên đĩa môi trường LB có bổ sung 20µl carbenicillin 50 µg/ml, 40µl X-gal 20 mg/ml, 20µl IPTG 100 mM. Sau đó nuôi ở 37ºC trong 18 giờ. Sau 18h, trên đĩa môi trường LB sẽ xuất hiện những khuẩn lạc trắng xen kẽ với các khuẩn lạc xanh. Trên môi trường LB có X-gal, những khuẩn lạc màu trắng là những cá thể có thể mang DNA plasmid đã gắn đoạn DNA ngoại lai, những khuẩn lạc màu xanh là những cá thể mang DNA plasmid không được gắn đoạn đoạn DNA ngoại lai. Vấn đề là liệu đoạn DNA ngoại lai có phải là từ sản phẩm PCR chúng ta mong muốn hay không. Một trong những phương pháp kiểm tra đó là tách chiết DNA plasmid và dùng DNA plasmid đó làm khuôn để PCR lần 2 với cặp mồi và chu trình nhiệt như lần
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
PCR thứ nhất. Nếu sản phẩm PCR được nhân lên có kích thước 1500 bp thì điều đó chứng tỏ dòng DNA plasmid đó đã được gắn đoạn DNA ngoại lai. Và dòng DNA plasmid đó sẽ được tinh sạch và được gửi đi giải trình tự để định tên.
2.2.5.4 Tách chiết DNA plasmid
DNA plasmid được tách chiết và làm sạch theo đúng hướng dẫn của hãng
Bioneer.
Bước 1: Lấy 1,8ml dịch khuẩn đã nuôi cho vào ống eppendorf 2ml, ly tâm 8000 vòng/phút trong 5 phút ở 4ºC. Sau đó đổ dịch và thu cặn tế bào.
Bước 2: Thêm 250µl buffer 1 vào ống, votex nhẹ cho tan hết cặn tế bào.
Bước 3: Thêm 250µl buffer 2 và mix nhẹ bằng cách đảo ống eppendorf lên xuống 3-4 lần.
Bước 4: Thêm 350µl buffer 3 vào ống và mix ngay lập tức để tránh hiện tượng kết tủa trong ống.
Bước 5: Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút ở 4ºC.
Bước 6: Chuyển dịch sau ly tâm lên cột (tránh lấy phần cặn), ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút.
Bước 7: Loại bỏ dịch chảy qua cột sau ly tâm, giữ lại cột và ống eppendorf. Bước 8: Thêm 700µl buffer 4 vào ống, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Bước 9: Loại bỏ dịch chảy qua cột, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút để cột khô hoàn toàn.
Bước 10: Loại bỏ dịch chảy qua cột, chuyển cột sang ống eppendorf 1,5ml. Bước 11: Thêm 25µl nước deion khử trùng vào ống, đợi khoảng 2 phút để nước thấm hết qua màng lọc. Sau đó ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút để thu sản phẩm cuối cùng.
2.2.5.5 Kiểm tra plasmid mang sản phẩm PCR mong muốn
Nguyên tắc:
DNA ngoại lai là sản phẩm của phản ứng PCR được đưa vào plasmid pBT, được plasmid nhân lên trong tế bào E.coli DH5 và được tách chiết như đã giới thiệu. Vấn đề là liệu đoạn DNA ngoại lai có phải là từ sản phẩm PCR chúng ta mong muốn hay không.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Một trong những phương pháp nhanh nhất là kiểm tra độ dài của đoạn DNA ngoại lai có đúng là sản phẩm trước khi dòng hóa hay không.
Plasmid pBT có độ dài là 2722 bp. Tại hai đầu của vùng tiếp nhận DNA ngoại lai, người ta bố trí hai điểm cắt của enzyme giới hạn BamH I.
Vị trí cắt của BamH I: G GATCC
CCTAG G
Do vậy khi cắt DNA của plasmid tái tổ hợp, chúng ta sẽ có hai băng DNA: một băng có độ dài 2722 bp của chính plasmid, còn băng kia có độ dài tương ứng với sản phẩm PCR (với điều kiện trong chuỗi DNA của sản phẩm PCR không có điểm cắt nào khác của BamH I). Nếu trong đó có điểm cắt BamH I, thì độ dài của sản phẩm PCR khi kiểm tra sẽ bằng tổng độ dài của các băng DNA cộng lại. Từ đó chúng ta biết sản phẩm PCR có được dòng hóa hay không. Từ đó, cho phép ta quyết định có nên tiến hành giải trình tự để biết chính xác trình tự nucleotide hay không.
Thành phần phản ứng: Dung dịch đệm : 1µl Enzyme cắt Bam HI : 0,5µl ADN plasmid : 3µl ddH2O : 5,5µl Tổng thể tích : 10µl
Các thành phần phản ứng được đảo trộn đều sau đó đặt ống phản ứng vào bể ổn nhiệt ở 37ºC trong 1 giờ. Điện di sản phẩm vừa cắt trên gel agarose 1% để kiểm tra kết quả.
2.2.5.6 Phương pháp xác định trình tự đoạn gene 16S rRNA
DNA được lựa chọn là mang đoạn gene mong muốn được gửi xác định trình tự trên máy đọc tự động ABI PRISM 3100 Avant Geneetic Analyzer sử dụng bộ kit BigDye Terminator V3.1 Cycle Sequencing. Trình tự nucleotide được xử lý bằng phần
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
mềm ABI PRISM 3100 Avant Data Collection v 1.0 và DNA Sequencing Analysis đó được so sánh với trình tự của các procaryot đã được công bố trên ngân hàng gene thế giới bằng chương trình FASTA.
2.2.5.7 Phương pháp xây dựng cây phát sinh chủng loại
Tiến hành so sánh trình tự đoạn gene 16S rRNA của vi sinh vật thu được với đoạn gene có kích thước và vị trí tương tự ở các vi sinh vật khác đã công bố trên ngân hàng dữ liệu gene thế giới EMBL và sử dụng phần mềm Cluxtal-X, Treeview để xây dựng cây phân loại.