Trình tự tách dòng gen 16S rRNA được thực hiện theo các bước:
Gắn sản phẩm PCR vào vector pBT và biến nạp vào tế bào E.coli DH5α.
Sản phẩm PCR nhân đoạn gen 16S rRNA được gắn vào vector pBT nhờ
enzyme T4 ligase và biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α.
1: Marker 1kb 2: Sản phẩm PCR
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Sau khi nuôi ở 370C trong 18 giờ trên môi trường LB đặc có chứa Carbe, X-
gal và IPTG đã xuất hiện những khuẩn lạc trắng xen kẽ những khuẩn lạc xanh (hình 3.5 (A)). Khuẩn lạc trắng là khuẩn lạc có thể mang DNA plasmid đã được gắn sản phẩm PCR nhân đoạn gen 16S rRNA, khuẩn lạc xanh là khuẩn lạc không đính đoạn DNA ngoại lai. Số lượng khuẩn lạc trắng nhiều hơn khuẩn lạc xanh chứng tỏ hiệu suất biến nạp là khá tốt.
A B
Hình 3.5: Kết quả biến nạp chủng BTL4(A), và điện di đồ DNA plasmid của
dòng số 2 từ BTL4 trên gel agarose 1% plasmid của chủng lạc mầu xanh (B)
Các khuẩn lạc trắng có thể mang vector chứa đoạn DNA cần thiết. Tuy nhiên, để kiểm tra lại một cách chắc chắn xem có phải khuẩn lạc trắng đó có mang đoạn gen cần thiết đã được gắn vào hay không chúng tôi tiến hành tách DNA plasmid và
điện di sản phẩm DNA plasmid được cắt bằng enzyme BamHI
* Tách DNA plasmid và kiểm tra các dòng khuẩn lạc thích hợp
Các khuẩn lạc lựa chọn được nuôi trong môi trường LB dịch để tách DNA plasmid theo Kit Bioneer. Sản phẩm DNA plasmid được điện di trên gel agarose 1% để lựa chọn dòng tế bào mang vector tái tổ hợp.
Kết quả điện di cho thấy trong 3 dòng khuẩn lạc được chọn thì chỉ có DNA plasmid của dòng số 2 nằm ở vị trí cao hơn mẫu đối chứng (DNA plasmid của khuẩn lạc xanh) (hình 3.5 (B)). Như vậy, dòng khuẩn lạc số 2 này có thể mang
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
vector tái tổ hợp chứa đoạn gen 16S rRNA nhân lên từ DNA tổng số của vi khuẩn BTL4. Do đó để kiểm tra xem liệu thực sự DNA plasmid của dòng số 2 có mang
sản phẩm mong muốn hay không chúng tôi đã dùng enzyme BamHI để cắt sản
phẩm DNA plasmid của dòng khuẩn lạc số 2. Sản phẩm cắt DNA plasmid sau đó được điện di trên gel agarose 1% (hình 3.6).
Hình 3.6: Sản phẩm cắt DNA plasmid của dòng số 2 từ BTL4
Trên hình 3.6 chúng tôi nhận thấy, sản phẩm cắt DNA plasmid của dòng số 2 đã xuất hiện một băng có kích thước khoảng 1500 bp, tương tự như kích thước của đoạn DNA ngoại lai đã được biến nạp. Như vậy, dòng plasmid số 2 có thể đã được gắn đoạn DNA mong muốn. Sau đó, DNA plasmid của dòng số 2 được tách và tinh sạch để xác định trình tự.