2. Mục tiờu và nội dung nghiờn cứu
3.5.1. Thực hiện RT-PCR, tỏch dũng và thu nhận đoạn gen pol của cỏc mẫu
Tiến hành tỏch ARN tổng số, thực hiện RT-PCR, tỏch dũng và thu nhận đoạn gen pol của mẫu HIV. ARN tổng số đƣợc tỏch bằng bộ kit QiAmp viral mini kit (hóng Qiagen theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất. Kiểm tra ARN tổng số bằng điện di trờn gel agarose 1%.
Sử dụng bộ kit RT–PCR một bƣớc (one-step RT–PCR Kit) của hóng QIAGEN (Mỹ). Thành phần phản ứng RT–PCR thực hiện với khuụn cú chứa ARN của HIV, đƣợc hỗn hợp trong ống nghiệm PCR (ống plastic chịu nhiệt, cú dung tớch 0,2 ul), bao gồm dung mụi phản ứng, mồi xuụi, mồi ngƣợc, enzyme sao chộp ngƣợc, nƣớc và khuụn, tổng dung tớch 25 ul. Chƣơng trỡnh cho chu trỡnh nhiệt của phản ứng RT-PCR, bao gồm:
Bƣớc 1: 450C trong 2 phỳt: 1 chu kỳ
Bƣớc 2: 950C trong 10 phỳt: 1 chu kỳ
- Cỏc bƣớc 3, 4, 5 đƣợc thực hiện lặp đi lặp lại trong 35 chu kỳ:
Bƣớc 3: 940C trong 20 giõy
Bƣớc 4: 550C trong 20 giõy
Bƣớc 5: 720C trong 40 giõy
Bƣớc 6: 720C trong 7 phỳt: 1 chu kỳ
Bảo quản sản phẩm ở nhiệt độ lạnh 40C cho đến khi kiểm tra sản phẩm.
M: chỉ thị phõn tử marker Lamda cắt bằng Hind III. 1.ARN tổng số của HIVT1; 2. ARN tổng số của HIVT2; 3. ARN tổng số của HIVT3; 4. ARN tổng số của HIVT4; 5. ARN tổng số của HIVT5; 6. ARN tổng số của HIVT6;7. ARN tổng số của HIVT7; 8. ARN tổng số của HIVT8.
M: chỉ thị phõn tử marker Lamda cắt bằng Hind III. M2: chỉ thị phõn tử marker 1 kb. (-): Mẫu đối chứng õm.1. Sản phẩm RT-PCR của HIVT1; 2. Sản phẩm RT-PCR của HIVT2; 3. Sản phẩm RT-PCR của HIVT3; 4. Sản phẩm RT-PCR của HIVT4; 5. Sản phẩm RT-PCR của HIVT5; 6. Sản phẩm RT-PCR của HIVT6; 7. Sản phẩm RT-PCR của HIVT7; 8. Sản phẩm RT-PCR của HIVT8.
Từ nguồn khuụn ARN đó tỏch chiết, chỳng tụi thu nhận đƣợc sản phẩm RT- PCR cú độ dài khoảng 170 bp (Hỡnh 3.15) Trờn hỡnh ảnh điện di cho thấy, cỏc sản phẩm RT-PCR đều cho 1 băng cú độ dài tƣơng ứng với dự kiến (~ 170 bp).
Sản phẩm RT-PCR đƣợc tinh sạch bằng bộ kit Qiaqiuck (Qiagen) và gắn vào vector tỏch dũng pCR2.1 và tiến hành tỏch tỏi tổ hợp, thu đƣợc cỏc clone cú khả năng chứa đoạn gen pol cú độ dài khoảng 170 bp, chọn lọc để giải trỡnh trỡnh tự (Hỡnh 3.16).
Trờn hỡnh ảnh điện di cho thấy:
- Mẫu HIVT1 và HIVT2 và HIVT3 tất cả cỏc clone (cl1, cl2, cl3) đều cú độ dài khoảng 170 bp.
- Mẫu HIVT4 cú 3 clone cú khả năng chứa gen pol (cl2, cl3, cl4) trong vector; - Mẫu HIVT5 cú 1 clone (cl3) và mẫu HIVT6 cú 1 clone (cl1);
- Mẫu HIVT7 cú 2 clone (cl1 và cl3) cú khả năng mang tỏi tổ hợp của gen pol. - Mẫu HIVT8 cả 3 clone đều cú khả năng chứa gen pol (cl1, cl2, cl3).
M: chỉ thị phõn tử marker Lamda cắt bằng Hind III. Cỏc sản phẩm ADN tỏi tổ hợp của gen pol: (A) HIVT1 + HIVT2; (B) HIVT3; (C) HIVT4; (D) HIVT5 + HIVT6; (E) HIVT7; (F) HIVT8, trong đú cỏc clone cú độ dài tƣơng ứng gen của pol (~170 bp) đƣợc đỏnh dấu bằng mũi tờn (→). Vector pCR 2.1 cú độ dài 3,9 kb.
Hỡnh 3.16: Hỡnh ảnh điện di kiểm tra cỏc sản phẩm ADN tỏi tổ hợp gen pol
Nhƣ vậy, gen pol của cỏc mẫu HIV trong nghiờn cứu đó đƣợc thu nhận và tỏch dũng thành cụng để tiến hành giải trỡnh trỡnh tự.
Sau khi giải trỡnh trỡnh tự, chỳng tụi thu đƣợc chuỗi nucleotide của gen pol
cú kớch thƣớc khoảng 170 bp, cỏc chuỗi này sẽ sử dụng đƣa vào Blast để thu nhận cỏc chuỗi đó đăng ký trong Ngõn hàng gen (Genbank), đối chiếu xỏc định với cỏc chuỗi khỏc của thế giới (Bảng 8).