2. Mục tiờu và nội dung nghiờn cứu
2.4. Phƣơng phỏp nghiờn cứu
Sử dụng phƣơng phỏp mụ tả cắt ngang những đối tƣợng đƣợc giỏm sỏt trọng điểm tại Hũa Bỡnh 2009-2013.
Sử dụng phƣơng phỏp thu thập, nghiờn cứu phõn tớch cỏc thụng tin sẵn cú cỏc đối tƣợng đƣợc xột nghiệm phỏt hiện tại Hũa Bỡnh 2009-2013.
Cỏc phƣơng phỏp và kỹ thuật trong nghiờn cứu sinh học phõn tử.
2.4.1 Phương phỏp làm xột nghiệm ELISA Genscreen HIV1/2 nguyờn lý Qui trỡnh làm phản ứng:
1. Viết danh sỏch mẫu.
2. Chuẩn bị dung dịch rửa (Washing solution-R2) pha tỷ lệ 1:10 ml dung dịch rửa + 9ml nƣớc cất 2 lần (pha 800ml cho cả khay 12 thanh).
3. Lấy phiến nhựa và cỏc thanh (Strips-R1) ra khỏi tỳi.
4. Cho vào mỗi giếng 25 àl dung dịch pha loóng huyết thanh (Sampledililuent-R6). - Cho 75 àl huyết thanh chứng õm (Negative Control-R3) vào giếng A1.
- Cho 75 àl huyết thanh ngƣỡng (Cut off-R4) vào giếng B1, C1, D1. - Cho 75 àl huyết thanh chứng dƣơng (Positive Control-R5) vào giếng E1. - Cho 75 àl huyết thanh bệnh nhõn vào cỏc giếng từ F1, G1, H1...
Trộn đều bằng cỏch hỳt lờn xuống 3 lần
Chỳ ý: Cho huyết thanh bệnh nhõn trước rồi mới cho chứng õm, chứng cut off và chứng dương)
5. Dỏn kớn phiến nhựa bằng băng dớnh.
6. Ủ phiến nhựa ở 370 C trong 30 phỳt ± 5 phỳt.
7. Bỏ băng dớnh, cho phiến nhựa vào mỏy rửa 3 lần, làm khụ phiến nhựa bằng cỏch ỳp phiến nhựa vào giấy thấm.
8. Cho vào mỗi giếng 100ml dung dịch chất liờn kết (Conjugate) và lắc nhẹ nhàng trong vũng 10 phỳt.
9. Dỏn phiến nhựa bằng băng dớnh và để 30 phỳt ở nhiệt độ phũng (18-30oC). 10. Bỏ băng dớnh, cho phiến nhựa và mỏy rửa 5 lần, làm khụ phiến nhựa bằng cỏch ỳp lờn giấy thấm.
11. Cho vào mỗi giếng 80ml dung dịch cơ chất đó pha (R8+R9) khụng cần đậy phiến nhựa, để ngay cả phiến nhựa vào hộp tối ở nhiệt độ phũng trong 30 phỳt.
Dung dịch cơ chất (R8+R9) này đƣợc pha trƣớc mỗi lần dựng theo tỷ lệ 1:11 nhƣ sau 1ml R9 (Concentrate chromogen Solution) + 10ml R8 (Rubtrate buffer) sau khi pha xong để dung dịch đó pha vào hộp tối trƣớc khi sử dụng.
12. Lấy ra dừng phản ứng bằng cỏch cho vào mỗi giếng 100 àl dung dịch phản ứng (Stoping solution-R10).
13. Cho vào mỏy đọc ở bƣớc súng 450/620. 14. Kiểm tra kết quả.
Tớnh toỏn và đọc kết quả:
1. Tớnh giỏ trị trung bỡnh của chứng ngƣỡng (Cut off) OD9B1 + ODC1 + ODD1
3 2. Tớnh giỏ trị ngƣỡng (Cut off)
C.O = ODR4 10 3. Tớnh hợp lệ của phản ứng:
- Độ hấp thụ của chứng õm (R3) phải nhỏ hơn 70% giỏ trị ngƣỡng Cut off: ODR3 < 0.7 x C.O
- Giỏ trị trung bỡnh của chứng Cut off phải lớn hơn 0.8: ODR4 >0.8 - Tỷ số:
ODR5
≥ 1.3 ODR4
4. Đọc kết quả:
- Những mẫu cú độ hấp thụ quang học nhỏ hơn giỏ trị ngƣỡng (C.O) đƣợc coi là õm tớnh với kỹ thuật Genscreen HIV 1/2.
- Những kết quả chỉ nhỏ hơn giỏ trị ngƣỡng C.O chỳt ớt (C,O-10%<OD<C.O) cần đƣợc đọc cẩn thận và nờn làm lại 2 lần
- Sau khi làm lại 2 lần, giỏ trị hấp thụ lần 2 nhỏ hơn giỏ trị ngƣỡng C.O thỡ mẫu đú đƣợc coi là õm tớnh với kỹ thuật Genscreen HIV 1/2.
- Sau khi làm lại, độ hấp thụ lần 2 lớn hơn giỏ trị ngƣỡng C.O, kết quả phản ứng lỳc đầu lặp lại, mẫu đú đƣợc coi là dƣơng tớnh với kỹ thuật Genscreen HIV 1/2
2.4.2 Phương phỏp làm xột nghiệm Serodia 1/2 HIV
+ Nguyờn lý: Cỏc hạt gelatin gắn khỏng nguyờn sẽ ngƣng kết khi gặp khỏng thể khỏng HIV trong cỏc mẫu huyết thanh hay huyết tƣơng.
+ Chuẩn bị:
- Dung dịch A là dung dịch pha loóng lọ C và D - Dung dịch B là dung dịch pha loóng huyết thanh - Lọ E là chứng dƣơng
Pha lọ C và D sau 30 phỳt mới làm xột nghiệm
- Chỳ ý: Pha lọ D trƣớc khi pha lọ C (Vỡ lọ C gắn khỏng nguyờn) - Phiến nhựa để trờn mặt phẳng trỏnh rung và đƣợc đậy
+ Xột nghiệm:
- Huyết thanh hay huyết tƣơng phải đƣợc ly tõm loại bỏ hồng cầu và cỏc thành phần khỏc
- Nhỏ 75 ml dung dịch pha lừng huyết thanh (Lọ B) vào giếng 1 và 25 ml dung dịch vào giếng 2và 3 tƣơng ứng 3:1:1
- Thờm 25 ml huyết thanh cần làm xột nghiệm vào giếng 1. Trộn đều từ giếng 1 đến giếng 3 rồi bỏ đi 25 ml sẽ cú tỷ lệ pha loóng là 1:4; 1:8; 1:16.
- Nhỏ 25 ml dung dịch hạt khụng gẵn khỏng nguyờn (Lọ D) vào giếng 2, nhỏ tiếp 25 ml dung dịch hạt cú gắn khỏng nguyờn vào giếng 3,4,5 nếu cần.
- Trộn đều bằng mỏy lắc. Đậy phiến, để ở mặt bàn khụng rung + Đọc kết quả:
- Phản ứng dƣơng tớnh đọc ở giếng 3:
* Vũng ngƣng kết rộng gắn kết phần đỏy giếng
* Viền của vũng ngƣng kết khụng đều, gợn hỡnh răng cƣa
- Phản ứng õm tớnh: hạt gelatin lắng trũn dƣới đỏy giếng thành một chấm nhƣ giếng 2
2.4.3. Phương phỏp phõn tớch số liệu
Số liệu Giỏm sỏt trọng điểm: đƣợc thu thập và nhập vào mỏy tớnh bằng phần mềm Ecxel 2007. Cỏc bảng và đồ thị phự hợp đƣợc sử dụng để trỡnh bày kết quả sau phõn tớch.
Số liệu Giỏm sỏt phỏt hiện: đƣợc làm sạch, nhập vào mỏy tớnh và đƣợc xử lý bằng phần mềm quản lý bệnh nhõn HIV Info 2.1.
2.5. Phƣơng phỏp sinh học phõn tử xỏc định HIV
Xột nghiệm phỏt hiện ARN của virus HIV hiện diện trong mẫu mỏu bệnh nhõn bị nhiễm HIV/AIDS bằng phƣơng phỏp PCR là xột nghiệm cho kết quả chớnh xỏc và độ đặc hiệu cao, cú thể phỏt hiện sớm nhiễm HIV, đặc biệt cú thể chẩn đoỏn nhiễm HIV cấp tớnh trong 3-12 tuần của giai đoạn cửa sổ khi mà cỏc xột nghiệm phỏt hiện khỏng thể cũn õm tớnh [14], [42].
Trong 10 ml huyết thanh HIV dƣơng tớnh cú khoảng 1.700.000 copy virus/ml [26]. Để nhõn bản một phần đoạn gen pol, cỏc mẫu mỏu nhiễm HIV đó đƣợc sử dụng để tỏch ARN và thực hiện phản ứng sao chộp ngƣợc RT-PCR. Cặp mồi nhõn bản đoạn gen pol là HIVF và HIVR nhõn bản chuỗi gen cú trỡnh tự 170 bp. Phản ứng PCR đƣợc thực hiện với 35 chu kỳ. Quy trỡnh thực hiện theo sơ đồ sau:
2.5.1. Tỏch chiết ARN tổng số (genomic ARN)
Sử dụng Bộ QiaAmp Viral Mini Kit của Hóng QIAGEN cung cấp. Kĩ thuật tỏch chiết đƣợc đƣợc tiến hành theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất.
ARN tổng số bao gồm hệ gen của HIV (nếu cú), sau khi tỏch chiết đƣợc bảo quản trong lạnh ở -20oC hoặc -70oC, và đƣợc sử dụng làm khuụn RT-PCR nhõn bản đoạn gen cần nghiờn cứu với cỏc cặp mồi đặc hiệu.
Hỡnh 2.1. Sơ đồ cỏc quỏ trỡnh nghiờn cứu phõn tớch gen pol đối với virus HIV của cỏc mẫu thu nhận tại tỉnh Hũa Bỡnh.
2.5.2. Thiết kế mồi cho HIV
Chỳng tụi đó chọn cặp mồi đặc hiệu để nhõn đoạn ARN của gen polymerase (pol) hệ gen HIV, dựa trờn thực hiện và cụng bố của tỏc giả Canto và cs (2006). Trỡnh tự nucleotide của cặp mồi nhƣ sau:
Mồi xuụi HIVF: 5’-GAGACACCAGGAATTAGATATCAGTACAATGT-3’. Bao gồm 32 nucleotide, định vị ở phần đầu gen pol của hệ gen HIV.
Mồi ngƣợc HIVR: 5’-CTAAATCAGATCCTACATATAAGTCATCATGT-3’. Bao gồm 32 nucleotide, định vị ở phần đầu gen pol của hệ gen HIV. Sản phẩm RT-PCR của đoạn gen pol này là 170 bp [26].
2.5.3. Thực hiện RT-PCR
Sử dụng bộ kit RT–PCR một bƣớc của hóng Invitrogen (Mỹ), nghĩa là phản ứng RT–PCR đƣợc thực hiện một bƣớc cho sản phẩm cuối cựng.
Thành phần phản ứng RT–PCR thực hiện với khuụn cú chứa ARN của HIV trong 1 ống PCR (ống plastic chịu nhiệt, cú dung tớch 0,2 ml), nhƣ sau:
Số thứ tự Thành phần Số lƣợng
1 Dung mụi phản ứng (2x reaction mix) 12,5 l 2 Enzym sao chộp ngƣợc (RT-platinum) 1,0 l 3 Mồi xuụi (10pmol/l) 1,5 l 4 Mồi ngƣợc(10pmol/l) 1,5 l
5 Nƣớc 6,5 l
6 Khuụn (ARN tổng số) 2,5 l
Tổng số 25,0 l
Hỡnh 2.2. Minh họa cấu trỳc hệ gen của HIV và vị trớ trờn gen pol để thực hiện RT- PCR thu nhận đoạn gen pol bằng cặp mồi HIVF – HIVR (~170 nucleotide).
Chu trỡnh nhiệt của phản ứng RT-PCR, bao gồm:
Bƣớc 1: 450C trong 2 phỳt: 1 chu kỳ
Bƣớc 2: 950C trong 10 phỳt: 1 chu kỳ
Cỏc bƣớc 3, 4, 5 đƣợc thực hiện lặp đi lặp lại trong 35 chu kỳ:
Bƣớc 3: 940C trong 20 giõy
Bƣớc 4: 500C trong 20 giõy
Bƣớc 5: 720C trong 40 giõy
Bƣớc 6: 720C trong 7 phỳt: 1 chu kỳ
Sau đú bảo quản sản phẩm ở nhiệt độ lạnh 40C cho đến khi kiểm tra sản phẩm.
2.5.4. Đối chiếu và so sỏnh xử lớ số liệu
Sử dụng cỏc phần mềm tin-sinh học trong đối chiếu giữa cỏc gen virus và so sỏnh kết quả bằng chƣơng trỡnh GENEDOC2.7. Sau khi giải trỡnh tự, thu nhận chuỗi nucleotide, thụng qua chƣơng trỡnh Blast trờn Ngõn hàng gen, truy cập thu nhận cỏc dữ liệu chuỗi gen đó đăng ký và xỏc định chớnh xỏc về nucleotide giữa cỏc gen của virus cú trong Ngõn hàng gen với đoạn gen thu đƣợc trong nghiờn cứu và tớnh hệ số tƣơng đồng về thành phần nucleotide của chuỗi gen pol đó đƣợc thu nhận.
Chƣơng 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả thực trạng nhiễm HIV tại Hũa Bỡnh (2009 – 2013)
Với đặc điểm về vị trớ địa lý, kinh tế, văn hoỏ xó hội của địa phƣơng cựng với cỏc tệ nạn xó hội nhƣ tiờm chớch ma tuý, nạn mại dõm v.v…đang gia tăng trờn địa bàn là những yếu tố nguy cơ làm gia tăng tỷ lệ ngƣời nhiễm HIV/AIDS. Trong khuụn khổ khúa luận này, chỳng tụi xin bỏo cỏo số liệu điều tra từ năm 2009 (đến thỏng 12 năm 2013 tại tỉnh Hũa Bỡnh, kết quả đƣợc thể hiện nhƣ sau:
Năm Nhiễm
mới Chuyển AIDS Số tử vong
Số lƣợng mẫu xỏc định HIV bằng SHPT 2009 239 195 107 02 (HIV-T1 ; HIV-T2) 2010 141 138 67 02 (HIV-T3 ; HIV-T4) 2011 162 158 62 01(HIV-T5) 2012 117 116 48 01(HIV-T6) 2013 68 33 30 02 (HIV-T7 ; HIV-T8) Tổng cộng 727 640 314 08 mẫu
Số nhiễm HIV chuyển sang giai đoạn AIDS đƣợc ghi nhận cú xu hƣớng giảm dần qua cỏc năm. Điều này, cú thể do tăng cƣờng chất lƣợng cụng tỏc giỏm sỏt bệnh nhõn ở tuyến cơ sở, cựng với đú là cụng tỏc truyền thụng đó cú kết quả tốt, sự phõn biệt đối xử liờn quan đến HIV giảm, do vậy số ngƣời sống với HIV/AIDS bộc lộ nhiều hơn, hay do việc tăng cƣờng cỏc dịch vụ điều trị HIV/AIDS tại địa bàn tỉnh.
Hỡnh 3.1. Số nhiễm HIV phỏt hiện mới từ 2009-2013
Với đặc điểm về vị trớ địa lý, kinh tế, văn húa- xó hội của địa phƣơng cựng với cỏc tệ nạn xó hội nhƣ : tiờm chớch ma tỳy, nạn mại dõm... làm cho cỏc ca nhiễm HIV mới vẫn cũn cao. Số nhiễm HIV mới đƣợc phỏt hiện hàng năm tại tỉnh cũn thấp và khỏ ổn định. So với cỏc tỉnh khỏc thuộc vựng Tõy Bắc thỡ số ngƣời nhiễm HIV mới chỉ ở mức trung bỡnh.
Mặc dự vậy, khụng thể chủ quan trong cụng tỏc phũng, chống HIV/AIDS bởi lý do sau: Dịch vụ tƣ vấn xột nghiệm HIV tự nguyện dấu tờn miễn phớ ngày càng thu hỳt khỏch hàng cú nguy cơ cao (ƣớc tớnh cú khoảng từ 12- 13% số khỏch hàng đƣợc xột nghiệm tại dịch vụ tƣ vấn xột nghiệm tự nguyện cú kết quả HIV dƣơng tớnh). Đa số cỏc trƣờng hợp nhiễm HIV mới đƣợc phỏt hiện tại trung tõm Chữa bệnh, Giỏo dục - Lao động xó hội, trại tạm giam, bệnh viện cỏc tuyến, trong khi số ngƣời cú nguy cơ cao tại cộng đồng tự nguyện xột nghiệm HIV ghi danh cũn chƣa nhiều. Đú cũng là một nguy cơ tiềm ẩn sự bựng phỏt dịch bất cứ lỳc nào nếu khụng cú chƣơng trỡnh can thiệp một cỏch mạnh mẽ và hiệu quả.
3.2. Đặc điểm của cỏc trƣờng hợp nhiễm HIV tại địa bàn tỉnh Hũa Bỡnh
3.2.1. Phõn bố tỷ lệ nhiễm HIV/AIDS theo địa phương và nhúm tuổi
HIV/AIDS đó cú mặt ở 100% số huyện, thành phố và 155/210 xó, phƣờng, thị trấn của tỉnh. Số nhiễm HIV nhiều nhất vẫn tập trung ở Thành phố Hũa Bỡnh, tiếp đến là cỏc huyện Lạc Sơn, Mai Chõu... và tiếp tục phỏt hiện cỏc xó, phƣờng mới cú ngƣời nhiễm HIV. Điều này chứng tỏ dịch vẫn đang trờn đà lan rộng, cựng với sự phỏt triển, những thành tựu đạt đƣợc trong lĩnh vực kinh tế-xó hội.
Theo kết quả nghiờn cứu của chỳng tụi ở bảng 2 thỡ những ngƣời bị nhiễm HIV đa số gặp ở lứa tuổi trẻ từ 19 - 29 tuổi chiếm tỷ lệ trờn 45%.
TT Huyện/TP Tuổi Tổng % 0 → 19 20 → 29 30 → 39 40 → 49 50 → 59 60 → 69 70 → 79 80 → 89 Khụn g rừ 1 Đà Bắc 0 16 20 5 0 0 0 0 0 41 2 2 Cao Phong 2 22 25 13 1 1 0 0 63 3,07 3 T.P Hũa Bỡnh 9 170 215 67 6 3 0 0 0 471 22,94 4 Kim Bụi 12 114 97 15 0 0 0 0 0 238 11,59 5 Kỳ Sơn 27 34 20 3 0 0 0 0 84 4,09 6 Lƣơng Sơn 5 70 57 15 0 0 0 0 0 147 7,16 7 Lạc Sơn 10 186 239 37 9 1 0 0 0 482 23,48 8 Lạc Thủy 2 24 30 9 2 1 0 0 0 68 3,31 9 Mai Chõu 4 151 160 35 3 1 0 0 0 354 17,24 10 Tõn Lạc 1 20 25 15 1 0 0 0 0 62 3,02 11 Yờn Thủy 1 113 24 1 1 1 1 0 0 41 2 12 Khụng rừ 0 1 1 0 0 0 0 0 0 2 0,1 Tổng cộng 46 814 927 232 25 8 0 0 0 2053 100 Tỷ lệ (%) 2,24 39,65 45,15 11,3 1,22 0,39 0,05 0 0
Số nhiễm HIV tập trung nhiều nhất ở độ tuổi từ 19 - 29 và 30 - 39. Đõy là nhúm tuổi năng động, giao lƣu nhiều và cũng là độ tuổi chủ yếu sử dụng ma tỳy. Trong vài năm trở lại đõy, số ngƣời nhiễm HIV độ tuổi 19-29 cú xu hƣớng giảm, trong khi độ tuổi 30-39 tăng nhẹ.
Độ tuổi nhiễm HIV nhiều nhất cũng là đối tƣợng khỏch hàng chủ yếu của phụ nữ MD. Do vậy, khả năng nhiễm HIV qua QHTD cũng rất cao và là hành vi chủ yếu làm lõy truyền HIV từ nhúm cú nguy cơ cao sang cỏc nhúm nguy cơ thấp hơn, nhƣ vợ, bạn tỡnh thƣờng xuyờn của họ. Họ cũng là lao động chớnh trong gia đỡnh mỡnh, do đú ảnh hƣởng khụng ớt đến thu nhập kinh tế gia đỡnh và hơn nữa là an ninh, kinh tế của xó hội.
3.2.2. Phõn bố tỷ lệ nhiễm HIV/AIDS theo giới tớnh
HIV lõy truyền cho mọi đối tƣợng, khụng phõn biệt ngƣời già hay trẻ em, phụ nữ hay nam giới... đỏnh giỏ mức độ lõy nhiễm HIV/AIDS trờn cỏc nhúm đối tƣợng đƣợc chia theo giới, để đề xuất cỏc giải phỏp can thiệp cú hiệu quả hơn. Kết quả đƣợc trỡnh bày ở Bảng 3 và Hỡnh 3. Năm Gới tớnh Tỷ lệ % Tổng cộng Nam Tỷ lệ % Nữ Tỷ lệ % Khụng rừ 2009 149 76,02 47 23,98 0 100 196 2010 82 84,54 15 15,46 0 100 97 2011 87 70,73 36 29,27 0 100 123 2012 76 69,72 33 30,28 0 100 109 2013 35 60,34 23 39,66 0 100 58 Tổng cộng 429 73,58 154 26,42 0 100 583 Tỷ lệ % Nhúm tuổi
Bảng 3.3. Tỷ lệ nhiễm HIV theo giới tớnh (2009-2013)
Số ngƣời nhiễm HIV hàng năm chủ yếu là nam giới. Điều này cũng phự hợp với đặc điểm hỡnh thỏi lõy truyền HIV tại Hũa Bỡnh thụng qua tiờm chớch ma tỳy chiếm phần lớn (Hỡnh 3).
Theo thống kờ, mặc dự tỷ lệ nam giới nhiễm HIV vẫn chiếm phần đại đa số, nhƣng tỷ lệ nữ nhiễm HIV cú xu hƣớng tăng dần qua từng năm. Trong tƣơng lai, cú thể cú sự cõn bằng giữa nam và nữ nhiễm HIV. Do vậy, về mặt lõu dài cần cú những chớnh sỏch và những hoạch định phũng, chống HIV/AIDS một cỏch phự hợp. Điều này cú thể giải thớch là do cú sự thay đổi về hỡnh thỏi lõy truyền. Số ngƣời nhiễm HIV qua QHTD đang tăng dần và cựng với đú ở trong nhúm ngƣời tiờm chớch ma tỳy cú xu hƣớng giảm, đồng nghĩa với việc giảm tiờm chớch ma tỳy khụng an toàn. Tuy vậy, trong vài năm tới nhiễm HIV vẫn tập trung ở nam giới là chớnh.
3.2.3. Phõn bố tỷ lệ nhiễm HIV/AIDS theo nhúm đối tượng