2. Mục tiờu và nội dung nghiờn cứu
1.9.1. Mục tiờu xột nghiệm HIV
Xột nghiệm HIV gồm 4 mục tiờu: 1. Giỏm sỏt HIV/AIDS. 2. An toàn truyền mỏu.
3. Chẩn đoỏn nhiễm HIV/AIDS. 4. Nghiờn cứu khoa học.
1.9.2. Cỏc phương cỏch xột nghiệm
Cỏc phƣơng cỏch xột nghiệm HIV phụ thuộc vào mục tiờu xột nghiệm:
a) Phƣơng cỏch I (ỏp dụng cho cụng tỏc an toàn truyền mỏu): Mẫu huyết thanh đƣợc coi là dƣơng tớnh với phƣơng cỏch I khi mẫu đú dƣơng tớnh với một trong cỏc thử nghiệm nhƣ: ELISA, SERODIA, hay thử nghiệm nhanh. Trong truyền
mỏu, mẫu mỏu đƣợc xột nghiệm với phƣơng cỏch I nếu dƣơng tớnh hay nghi ngờ đều phải loại bỏ.
b) Phƣơng cỏch II (ỏp dụng cho giỏm sỏt trọng điểm): Mẫu huyết thanh đƣợc
coi là dƣơng tớnh với phƣơng cỏch II khi mẫu đú dƣơng tớnh cả 2 lần xột nghiệm bằng 2 loại sinh phẩm với nguyờn lý và chuẩn bị khỏng nguyờn khỏc nhau.
c) Phƣơng cỏch III (ỏp dụng cho chẩn đoỏn cỏc trường hợp nhiễm HIV):
Mẫu huyết thanh đƣợc coi là dƣơng tớnh với phƣơng cỏch III khi mẫu đú dƣơng tớnh cả 3 lần xột nghiệm bằng 3 loại sinh phẩm với nguyờn lý và chuẩn bị khỏng nguyờn khỏc nhau.
1.9.3. Cỏc phương phỏp thu thập mẫu mỏu
- Xột nghiệm giữ bớ mật tự nguyện: Thụng tin cỏ nhõn và kết quả xột nghiệm của ngƣời tự nguyện xột nghiệm HIV đều phải giữ bớ mật.
- Xột nghiệm dấu tờn tự nguyện: Một cỏ nhõn tự nguyện đến xột nghiệm HIV nhƣng khụng cung cấp tờn và địa chỉ mà thay bằng một mó số. Ngƣời đú cú thể biết kết quả xột nghiệm của mỡnh nếu họ muốn.
- Xột nghiệm dấu tờn hoàn toàn: Mẫu mỏu đƣợc thu thập nhƣng khụng cần biết tờn và địa chỉ, khụng ai biết kết quả xột nghiệm.
- Xột nghiệm theo quy định: Cỏc mẫu mỏu phải đƣợc xột nghiệm sàng lọc HIV nhằm trỏnh lõy lan HIV qua truyền mỏu, cho hay ghộp cỏc cơ quan phủ tạng, tinh dịch.
- Xột nghiệm bắt buộc: Mẫu mỏu bắt buộc phải xột nghiệm HIV mà khụng quan tõm đến ngƣời đú cú đồng ý hay khụng.
1.10. Chƣơng trỡnh điều trị nghiện cỏc chất dạng thuốc phiện bằng thuốc Methadone Methadone
Tớnh đến ngày 31/12/2013 Chƣơng trỡnh đƣợc triển khai tại 30 tỉnh, thành phố với 80 điểm điều trị và điều trị cho 15.542 bệnh nhõn. Năm 2013 số tỉnh triển khai chƣơng trỡnh Methadone tăng lờn 10 tỉnh, tăng thờm 20 điểm điều trị, số ngƣời nghiện chớch ma tỳy đƣợc điều trị Methadone tăng 26,8% so với năm 2012. Hoạt động của chƣơng trỡnh Methadone hiện nay cũn phụ thuộc nhiều vào dự ỏn, rất ớt tỉnh chủ động đƣợc nguồn nhõn lực, đặc biệt sắp xếp bố trớ nhõn lực cho chƣơng trỡnh này cũn hạn chế, cỏc điểm điều trị Methadone cũ gặp nhiều khú khăn trong
việc duy trỡ trả lƣơng cho nhõn lực khi cỏc chƣơng trỡnh dự ỏn ngừng hoạt động hoặc bị cắt giảm kinh phớ. Vỡ vậy mặc dự cỏc văn bản quy định, hƣớng dẫn triển khai chƣơng trỡnh Methadone .
Cỏc phƣơng phỏp hiện cú chủ yếu hỗ trợ ngƣời bệnh vƣợt hội chứng cai một cỏch nhẹ nhàng hơn, nhằm hạn chế biến chứng của hội chứng cai. Thờm nữa, việc điều trị lõu dài, chống tỏi nghiện cũn kộm hiệu quả (tỷ lệ tỏi nghiện trờn 90%). Trong điều trị cần phối hợp với cỏc liệu phỏp khỏc nhƣ liệu phỏp nhận thức hành vi, liệu phỏp gia đỡnh, liệu phỏp nhúm và quản lý bằng thể chế [37].
Hiện nay, một trong những phƣơng phỏp đƣợc trờn thế giới đỏnh giỏ cao, hiệu quả, dễ thực hiện và đƣợc ỏp dụng rộng rói là phƣơng phỏp điều trị nghiện bằng thuốc Methadone. Đõy là một trong những chƣơng trỡnh hành động hiệu quả kết hợp của Tổ chức Y tế thế giới trong chiến lƣợc toàn cầu với Ủy ban Quốc gia phũng chống HIV/AIDS [45], [46], [47].
Phƣơng phỏp này với ƣu điểm là cú tỏc dụng dung nạp chộo với cỏc chất dạng thuốc phiện, do đú ngƣời bệnh khụng xuất hiện hội chứng cai và thốm chất ma tỳy. Thời gian bỏn hủy kộo dài 24-36 giờ (Buprenophine: 48h; LAAM: 72h), chỉ cần dựng 1 liều duy nhất trong ngày nờn nồng độ ổn định. Hiệu quả cao với đƣờng uống, trỏnh ngƣời bệnh phải tiờm chớch và trỏnh sốc thuốc do tiờm chớch. Methadone dung nạp chậm nờn trỏnh đƣợc khuynh hƣớng tăng liều. Cai Methadone dễ hơn cai heroin (giảm liều từ từ cho phự hợp với sự thớch nghi của ngƣời bệnh) và cú hiệu quả kinh tế cao.
Mục tiờu của phƣơng phỏp này nhằm làm giảm sử dụng ma tỳy bất hợp phỏp, giảm tỷ lệ tỏi phỏt dựng chất ma tỳy; giảm tỷ lệ phạm phỏp liờn quan đến tội phạm nhƣ: buụn bỏn ma tỳy, trộm cƣớp, mại dõm, giết ngƣời... giảm tỷ lệ lõy truyền viờm gan B, C, HIV do tiờm chớch ma tỳy; giảm tỷ lệ tai nạn lao động, tai nạn giao thụng, tử vong do dựng quỏ liều ma tỳy. Theo đú cú thể phục hồi chức năng sinh lý, lao động, tỏi hũa nhập gia đỡnh, cộng đồng và xó hội. Nhiều cụng trỡnh nghiờn cứu tại cỏc nƣớc cho thấy hiệu quả của việc điều trị nghiện cỏc chất dạng thuốc phiện bằng thuốc Methadone đem lại cỏc lợi ớch về kinh tế, xó hội, an ninh trật tự và đạt hiệu quả cao.
Chƣơng trỡnh điều trị nghiện bằng Methadone đó đƣợc ứng dụng tại Trung tõm Phũngchống HIV/AIDS của tỉnh Hũa Bỡnh. Sau khi tham gia chƣơng trỡnh Methadone, đa số bệnh nhõn cú cải thiện về sức khỏe thể chất và tõm thần, chất lƣợng cuộc sống và chuyển biến tớch cực về thỏi độ, hành vi cuộc sống. Sự cải thiện tớch cực về thay đổi thỏi độ, hành vi là những thành cụng đỏng ghi nhận của chƣơng trỡnh. Thời gian bệnh nhõn tham gia điều trị càng dài thỡ mức độ ổn định về sức khỏe thể chất, tõm thần và chất lƣợng cuộc sống của bệnh nhõn càng cao. Sau 12 thỏng điều trị, tỷ lệ bệnh nhõn cú nguy cơ trầm cảm giảm từ 80% xuống cũn 15%. Chất lƣợng cuốc sống của bệnh nhõn cũng cú những chuyển biến tớch cực. Việc mở cơ sở điều trị Methadone hiện nay tại tỉnh Hũa Bỡnh là thực sự cần thiết để làm giảm số ngƣời nhiễm HIV do tiờm chớch ma tỳy, giảm số ngƣời tử vong, giảm số vụ vi phạm trật tự xó hội, ổn định đời sống cho ngƣời nghiện ma tỳy và làm giảm cỏc chi phớ liờn quan đến luật phỏp, y tế, xó hội, bảo hiểm... nhằm hƣớng tới một tƣơng lai ngƣời NCMT sẽ hũa nhập trong cộng đồng, tỡm đƣợc việc làm và ổn định cuộc sống.
1.11. Sự cần thiết xỏc định HIV/AIDS bằng phƣơng phỏp sinh học phõn tử
Trờn thế giới nhiều tỏc giả đó nghiờn cứu về sự song nhiễm của HIV với HCV (hepatitis C virus). Một số cụng trỡnh đó cụng bố cú sự đồng nhiễm của virus HIV với cỏc loại virus cơ hội khỏc [43].
Ở Việt Nam, cỏc nghiờn cứu về HIV-1 chỉ cú một số tỏc giả nghiờn cứu trong những năm gần đõy. Cỏc nghiờn cứu về protease HIV-1 chỉ tập trung vào xỏc định nhúm virus gõy bệnh chủ yếu ở ngƣời Việt Nam và tỡm ra một số đột biến liờn quan đến khỏng thuốc [36], [38], [40], [41]. Một số nghiờn cứu của trong nhõn dũng, biểu hiện và nghiờn cứu một số tớnh chất của protease từ HIV-1 tại Việt Nam [9]; nghiờn cứu điều tra về tỡnh trạng nhiễm HIV, cỏc nhiễm trựng lõy qua đƣờng tỡnh dục ở phụ nữ bỏn dõm tại Hà Nội [12].
Do con ngƣời khi bị nhiễm HIV/AIDS làm hệ miễn dịch bị suy giảm dẫn đến dễ mắc cỏc bệnh cơ hội hoặc bị bội nhiễm (lao, nhiễm trựng, viờm gan B, viờm gan C…) vỡ vậy để giỳp chẩn đoỏn chớnh xỏc và cú thể phỏt hiện virus HIV ở giai đoạn sớm (giai đoạn cửa sổ) mà cỏc kit chẩn đoỏn miễn dịch cũn õm tớnh thỡ biện phỏp rất cần thiết là sử dụng kỹ thuật sinh học phõn tử trong chẩn đoỏn sớm nhiễm HIV. Vỡ vậy, trong nghiờn cứu này nhằm thẩm định chớnh xỏc virus HIV, chỳng tụi tiến hành xỏc định bằng phƣơng phỏp PCR sử dụng một phần của gen pol. Đõy là vựng gen polymerase mó hoỏ cho cỏc enzym: reverve transcriptase (RT: Enzym sao mó ngƣợc), protease và endonuclease (cũn gọi khỏng nguyờn integrase).
Chƣơng 2 - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
2.1. Đối tƣợng nghiờn cứu
- Những ngƣời đƣợc xột nghiệm huyết thanh học tỡm khỏng thể theo bỏo cỏo giỏm sỏt trọng điểm tại tỉnh Hũa Bỡnh từ năm 2009 đến năm 2013
- Những ngƣời đƣợc xột nghiệm theo bỏo cỏo Giỏm sỏt phỏt hiện của tỉnh Hũa Bỡnh từ 2009-2013
2.2. Địa điểm và thời gian nghiờn cứu
- Địa điểm: 11 huyện, thành phố thuộc địa bàn của tỉnh Hũa Bỡnh.
- Thời gian: Từ thỏng 5/2012 đến thỏng 5/2014
- Địa điểm thực hiện nghiờn cứu: phũng xột nghiệm HIV/AIDS của Trung tõm phũng chống HIV/AIDS tỉnh Hũa Bỡnh và phũng thớ nghiệm sinh học phõn tử của Phũng Miễn dịch học – Viện Cụng nghệ sinh học thuộc Viện Hàn lõm Khoa học và Cụng nghệ Việt Nam.
2.3. Vật liệu nghiờn cứu
2.3.1. Mẫu nghiờn cứu
- Giỏm sỏt trọng điểm: Số mẫu xột nghiệm huyết thanh học từ 2009-2013. - Giỏm sỏt phỏt hiện: Số ca bệnh đƣợc ghi nhận từ 2009-2013.
2.3.2. Húa chất nghiờn cứu
+ Bộ kớt Serodia-HIV + Bộ kớt thử Determine + Bộ sinh phẩm ELISA
+ Bộ dàn ELISA gồm cú: mỏy rửa; mỏy ủ; mỏy đọc kết quả; mỏy li tõm; mỏy lắc và cỏc phụ trợ khỏc (bơm kim tiờm, Pippet man, đầu cụn...).
+ Bộ kit tỏch chiết ARN tổng số của hóng Qiagen (Mỹ). + Bộ kit RT-PCR (hóng Qiagen)
+ Bộ kit tỏch plasmid tỏi tổ hợp (Bioneer – Hàn Quốc).
+ Bộ điện di, mỏy soi gel + chụp ảnh của hóng Dol phin (Mỹ).
+ Một số húa chất chuyờn dụng trong sinh học phõn tử, cỏc enzyme hạn chế của hóng Fermentas…
2.4. Phƣơng phỏp nghiờn cứu
Sử dụng phƣơng phỏp mụ tả cắt ngang những đối tƣợng đƣợc giỏm sỏt trọng điểm tại Hũa Bỡnh 2009-2013.
Sử dụng phƣơng phỏp thu thập, nghiờn cứu phõn tớch cỏc thụng tin sẵn cú cỏc đối tƣợng đƣợc xột nghiệm phỏt hiện tại Hũa Bỡnh 2009-2013.
Cỏc phƣơng phỏp và kỹ thuật trong nghiờn cứu sinh học phõn tử.
2.4.1 Phương phỏp làm xột nghiệm ELISA Genscreen HIV1/2 nguyờn lý Qui trỡnh làm phản ứng:
1. Viết danh sỏch mẫu.
2. Chuẩn bị dung dịch rửa (Washing solution-R2) pha tỷ lệ 1:10 ml dung dịch rửa + 9ml nƣớc cất 2 lần (pha 800ml cho cả khay 12 thanh).
3. Lấy phiến nhựa và cỏc thanh (Strips-R1) ra khỏi tỳi.
4. Cho vào mỗi giếng 25 àl dung dịch pha loóng huyết thanh (Sampledililuent-R6). - Cho 75 àl huyết thanh chứng õm (Negative Control-R3) vào giếng A1.
- Cho 75 àl huyết thanh ngƣỡng (Cut off-R4) vào giếng B1, C1, D1. - Cho 75 àl huyết thanh chứng dƣơng (Positive Control-R5) vào giếng E1. - Cho 75 àl huyết thanh bệnh nhõn vào cỏc giếng từ F1, G1, H1...
Trộn đều bằng cỏch hỳt lờn xuống 3 lần
Chỳ ý: Cho huyết thanh bệnh nhõn trước rồi mới cho chứng õm, chứng cut off và chứng dương)
5. Dỏn kớn phiến nhựa bằng băng dớnh.
6. Ủ phiến nhựa ở 370 C trong 30 phỳt ± 5 phỳt.
7. Bỏ băng dớnh, cho phiến nhựa vào mỏy rửa 3 lần, làm khụ phiến nhựa bằng cỏch ỳp phiến nhựa vào giấy thấm.
8. Cho vào mỗi giếng 100ml dung dịch chất liờn kết (Conjugate) và lắc nhẹ nhàng trong vũng 10 phỳt.
9. Dỏn phiến nhựa bằng băng dớnh và để 30 phỳt ở nhiệt độ phũng (18-30oC). 10. Bỏ băng dớnh, cho phiến nhựa và mỏy rửa 5 lần, làm khụ phiến nhựa bằng cỏch ỳp lờn giấy thấm.
11. Cho vào mỗi giếng 80ml dung dịch cơ chất đó pha (R8+R9) khụng cần đậy phiến nhựa, để ngay cả phiến nhựa vào hộp tối ở nhiệt độ phũng trong 30 phỳt.
Dung dịch cơ chất (R8+R9) này đƣợc pha trƣớc mỗi lần dựng theo tỷ lệ 1:11 nhƣ sau 1ml R9 (Concentrate chromogen Solution) + 10ml R8 (Rubtrate buffer) sau khi pha xong để dung dịch đó pha vào hộp tối trƣớc khi sử dụng.
12. Lấy ra dừng phản ứng bằng cỏch cho vào mỗi giếng 100 àl dung dịch phản ứng (Stoping solution-R10).
13. Cho vào mỏy đọc ở bƣớc súng 450/620. 14. Kiểm tra kết quả.
Tớnh toỏn và đọc kết quả:
1. Tớnh giỏ trị trung bỡnh của chứng ngƣỡng (Cut off) OD9B1 + ODC1 + ODD1
3 2. Tớnh giỏ trị ngƣỡng (Cut off)
C.O = ODR4 10 3. Tớnh hợp lệ của phản ứng:
- Độ hấp thụ của chứng õm (R3) phải nhỏ hơn 70% giỏ trị ngƣỡng Cut off: ODR3 < 0.7 x C.O
- Giỏ trị trung bỡnh của chứng Cut off phải lớn hơn 0.8: ODR4 >0.8 - Tỷ số:
ODR5
≥ 1.3 ODR4
4. Đọc kết quả:
- Những mẫu cú độ hấp thụ quang học nhỏ hơn giỏ trị ngƣỡng (C.O) đƣợc coi là õm tớnh với kỹ thuật Genscreen HIV 1/2.
- Những kết quả chỉ nhỏ hơn giỏ trị ngƣỡng C.O chỳt ớt (C,O-10%<OD<C.O) cần đƣợc đọc cẩn thận và nờn làm lại 2 lần
- Sau khi làm lại 2 lần, giỏ trị hấp thụ lần 2 nhỏ hơn giỏ trị ngƣỡng C.O thỡ mẫu đú đƣợc coi là õm tớnh với kỹ thuật Genscreen HIV 1/2.
- Sau khi làm lại, độ hấp thụ lần 2 lớn hơn giỏ trị ngƣỡng C.O, kết quả phản ứng lỳc đầu lặp lại, mẫu đú đƣợc coi là dƣơng tớnh với kỹ thuật Genscreen HIV 1/2
2.4.2 Phương phỏp làm xột nghiệm Serodia 1/2 HIV
+ Nguyờn lý: Cỏc hạt gelatin gắn khỏng nguyờn sẽ ngƣng kết khi gặp khỏng thể khỏng HIV trong cỏc mẫu huyết thanh hay huyết tƣơng.
+ Chuẩn bị:
- Dung dịch A là dung dịch pha loóng lọ C và D - Dung dịch B là dung dịch pha loóng huyết thanh - Lọ E là chứng dƣơng
Pha lọ C và D sau 30 phỳt mới làm xột nghiệm
- Chỳ ý: Pha lọ D trƣớc khi pha lọ C (Vỡ lọ C gắn khỏng nguyờn) - Phiến nhựa để trờn mặt phẳng trỏnh rung và đƣợc đậy
+ Xột nghiệm:
- Huyết thanh hay huyết tƣơng phải đƣợc ly tõm loại bỏ hồng cầu và cỏc thành phần khỏc
- Nhỏ 75 ml dung dịch pha lừng huyết thanh (Lọ B) vào giếng 1 và 25 ml dung dịch vào giếng 2và 3 tƣơng ứng 3:1:1
- Thờm 25 ml huyết thanh cần làm xột nghiệm vào giếng 1. Trộn đều từ giếng 1 đến giếng 3 rồi bỏ đi 25 ml sẽ cú tỷ lệ pha loóng là 1:4; 1:8; 1:16.
- Nhỏ 25 ml dung dịch hạt khụng gẵn khỏng nguyờn (Lọ D) vào giếng 2, nhỏ tiếp 25 ml dung dịch hạt cú gắn khỏng nguyờn vào giếng 3,4,5 nếu cần.
- Trộn đều bằng mỏy lắc. Đậy phiến, để ở mặt bàn khụng rung + Đọc kết quả:
- Phản ứng dƣơng tớnh đọc ở giếng 3:
* Vũng ngƣng kết rộng gắn kết phần đỏy giếng
* Viền của vũng ngƣng kết khụng đều, gợn hỡnh răng cƣa
- Phản ứng õm tớnh: hạt gelatin lắng trũn dƣới đỏy giếng thành một chấm nhƣ giếng 2
2.4.3. Phương phỏp phõn tớch số liệu
Số liệu Giỏm sỏt trọng điểm: đƣợc thu thập và nhập vào mỏy tớnh bằng phần mềm Ecxel 2007. Cỏc bảng và đồ thị phự hợp đƣợc sử dụng để trỡnh bày kết quả sau phõn tớch.
Số liệu Giỏm sỏt phỏt hiện: đƣợc làm sạch, nhập vào mỏy tớnh và đƣợc xử lý bằng phần mềm quản lý bệnh nhõn HIV Info 2.1.
2.5. Phƣơng phỏp sinh học phõn tử xỏc định HIV
Xột nghiệm phỏt hiện ARN của virus HIV hiện diện trong mẫu mỏu bệnh nhõn bị nhiễm HIV/AIDS bằng phƣơng phỏp PCR là xột nghiệm cho kết quả chớnh xỏc và độ đặc hiệu cao, cú thể phỏt hiện sớm nhiễm HIV, đặc biệt cú thể chẩn đoỏn nhiễm HIV cấp tớnh trong 3-12 tuần của giai đoạn cửa sổ khi mà cỏc xột nghiệm phỏt hiện khỏng thể cũn õm tớnh [14], [42].
Trong 10 ml huyết thanh HIV dƣơng tớnh cú khoảng 1.700.000 copy virus/ml [26]. Để nhõn bản một phần đoạn gen pol, cỏc mẫu mỏu nhiễm HIV đó đƣợc sử dụng để tỏch ARN và thực hiện phản ứng sao chộp ngƣợc RT-PCR. Cặp mồi nhõn bản đoạn gen pol là HIVF và HIVR nhõn bản chuỗi gen cú trỡnh tự 170 bp. Phản ứng PCR đƣợc thực hiện với 35 chu kỳ. Quy trỡnh thực hiện theo sơ đồ sau:
2.5.1. Tỏch chiết ARN tổng số (genomic ARN)
Sử dụng Bộ QiaAmp Viral Mini Kit của Hóng QIAGEN cung cấp. Kĩ thuật tỏch chiết đƣợc đƣợc tiến hành theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất.
ARN tổng số bao gồm hệ gen của HIV (nếu cú), sau khi tỏch chiết đƣợc bảo quản trong lạnh ở -20oC hoặc -70oC, và đƣợc sử dụng làm khuụn RT-PCR nhõn bản đoạn gen cần nghiờn cứu với cỏc cặp mồi đặc hiệu.