- Phân tắch, giám ựịnh các mẫu nhằm xác ựịnh sự có mặt của virus lùn sọc ựen bằng phương pháp RT-PCR one step, PTA-ELISA.
2.3.4.1. Phương pháp PTA-ELISA
* Bước 1: Cố ựịnh dịch chiết rầy lưng trắng vào bản ELISA
Mỗi cá thể rầy lưng trắng ựược cho vào ống eppendorf nghiền nát trong 300 ộl dung dịch ựệm Cacbonate. Dịch rầy sau khi ựược nghiền ựược cho vào giếng với lượng 100 ộl/ giếng. Gói bản ELISA trong tờ khăn giấy có thấm nước ựể giữ ẩm, gói kắn bản ELISA trong túi nilon. Sau ựó ủ ở 40c qua ựêm. Sau khi ủ bản ELISA ựược rửa bằng máy rửa hoặc rửa thủ công 5 lần, mỗi lần cách nhau 3 phút. Sau ựó làm khô bản ELISA bằng cách vẩy khô bản ELISA và úp ngược trên giấy thấm.
* Bước 2: Cố ựịnh IgG bậc 1 của virus lùn sọc ựen phương Nam vào bản
ELISA
- Hoà tan IgG bậc 1 vào dung dịch conjugate buffer. Nồng ựộ thắch hợp là 1 ộl/ 200 ộl conjugate buffer. Cố ựịnh 100 ộl igg ựặc hiệu vi rút cho vào mỗi giếng của bản ELISA. Gói bản ELISA trong tờ khăn giấy có thấm nước ựể giữ ẩm, gói kắn bản ELISA trong túi nilon. Sau ựó ủ ở 370c trong 4 giờ hoặc ủ ở 40c qua ựêm. Sau khi ủ, bản ELISA ựược rửa như bước 1. Sau ựó làm khô bản ELISA bằng cách vẩy khô bản ELISA và úp ngược trên giấy thấm.
* Bước 3: Cố ựịnh IgG 2 của virus lùn sọc ựen phương Nam vào bản ELISA
- Hoà tan IgG bậc 2 dung dịch conjugate buffer. Nồng ựộ thắch hợp là 1 ộl/ 4000 ộl conjugate buffer. Cho vào giếng với lượng 100 ộl/ giếng. Gói bản ELISA trong tờ khăn giấy có thấm nước ựể giữ ẩm, gói kắn bản ELISA trong túi nilon. Sau ựó ủ ở 370c trong 4 giờ hoặc ủ ở 40c qua ựêm. Sau khi ủ bản ELISA ựược rửa như ở bước 1.
* Bước 4: Cố ựịnh chất nền và ựánh giá kết quả
- Hoà tan chất nền (phosphate substrate) với nồng ựộ 1mg/ ml dung dịch ựệm diethanolamine, cho vào giếng với lượng 100 ộl/giếng. ủ bản ELISA ở nhiệt ựộ phòng khoảng 30 phút ựến 1 giờ. Những giếng cho kết quả phản ứng dương tắnh là những giếng có phản ứng xảy ra và tạo thành màu vàng sáng.
Ngừng phản ứng bằng cách cho NaOH 3M vào bản ELISA với liều lượng 50 ộl/ giếng.
đọc phản ứng bằng mắt hoặc bằng máy ựọc ELISA ở bước sóng 405 nm. * Bước 5. Kết luận
- Dựa trên cơ sở chỉ số OD ựọc ựược bằng máy ựọc ELISA ở bước sóng 405 nm ựể kết luận mẫu kiểm tra có bị nhiễm bệnh hay không.
+ Nếu trị số OD cuả các mẫu kiểm tra (giá trị Blank data cuả các mẫu kiểm tra) > 2 lần trị số OD cuả ựối chứng âm (nghiã là lớn hơn 2 lần giá trị trung bình cuả ựối chứng âm), kết luận mẫu ựó nhiễm bệnh.
2.3.4.2. Phương pháp RT-PCR
* Chiết RNA tổng số từ cây bệnh bằng Liti clorua (LiCl).
Bước 1: Ủ ựệm chiết CTAB (cứ 1 mẫu chiết cần 1ml ựệm) ựã bổ sung β-Mercaptathanol (BME) với tỉ lệ 1ml ựệm CTAB :10 ộl BME trong bể nhiệt ở nhiệt ựộ 60oC trong 30 phút.
Bước 2 : Lấy 0,2g mô lá bệnh nghiền với 1ml CTAB bằng chày cối sứ (nghiền ựến khi dung dịch thu ựược là một thể ựồng nhất). Hút 600 ộl dịch chiết vào tube 1,5 ml.
Bước 3: Li tâm 13000 vòng/phút trong 1phút, thu dịch trên tủa (500 ộl), loại bỏ cặn.
Bước 4 : Thêm Chloroform : Iso amyl alcolhol (24 :1) vào tube với tỉ lệ thể tắch tương ựương. đảo ựều tube.
Bước 6 : Lặp lại các bước 3, 4, 5 thêm một lần nữa.
Bước 7: Bổ sung LiCl 10M với thể tắch bằng 1/4 dịch trong tube (100 ộl). đảo ựều tube. Li tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút. Loại bỏ dịch phắa trên, thu lấy cặn RNA tổng số.
Bước 8: Rửa cặn bằng Ethanol 70o hai lần.
Bước 9: Làm khô cặn bằng cách mở nắp tube và ựể ở nhiệt ựộ phòng trong 30 phút.
Bước 10: Hòa cặn trong 50 ộl nước cất vô trùng và bảo quản trong tủ - 80oC. * Phản ứng RT-PCR Cặp mồi ựặc hiệu: RB-S10-F2: 5ỖTCCATAATGGCTGACATAAGAC3Ỗ RB-S10-R2: 5ỖCATTTGAGCAGGAACTTCACG3Ỗ Thành phần Lượng (ộl) Chu trình PCR H2O dd khử trùng 9.8 2X Reaction Mix 12.5 50 oC 30Ỗ 94oC 4Ỗ X1 RB-S10-F2 0.5 RB-S10-R2 0.5 E mix 0.2 94oC 40ỖỖ 52oC 40ỖỖ 68oC 1Ỗ X35 RNA 1 Tổng thể tắch 24.5 68oC 5Ỗ 20oC 5Ỗ X1
* Kiểm tra kết quả RT-PCR bằng ựiện di agarose
1. Pha ựệm ựiện di TAE 1x từ dung dịch gốc (TAE 5x): lấy 100 ml TAE 5x cho vào cốc ựong, bổ sung thêm 400 ml nước cất, lắc ựều.
2. Chuẩn bị bản gel: câm 1g agarose cho vào trong lọ thủy tinh chịu nhiệt, bổ sung 100 ml TAE 1x, lắc ựều và cho vào lò vi sóng ựể hòa tan
agarose (khoảng 3 phút). Sau khi agarose ựã tan hoàn toàn, bổ sung 2ộl Ethidium Bromide, lắc ựều, ựể lọ ở nhiệt ựộ phòng. Khi dung dịch agarose 1% ở trong khoảng 50ỨC thì ựổ ra khay gel ựã ựặt sẵn lược (dày khoảng 0,6 cm). để khay gel ựông ở nhiệt ựộ phòng là 30 phút.
3. Chuẩn bị mẫu ựiện di: Lấy các tube 0,5 ml ựã hấp khử trùng, ựánh số thứ tự. Cho vào mỗi tube 2ộl ựệm cài gen (loading dye) 6x và 10ộl sản phẩm PCR hoặc RT-PCR. Trộn ựều và ly tâm nhanh (spin) trong 5 giây.
4. Sau 30 phút ựể khay gel ở nhiệt ựộ phòng thì tiến hành rút lược (chú ý thao tác khéo tránh ựể vỡ giếng).
5. đặt cả khay gel vào bể ựiện di, ựổ dung dịch ựệm TAE 1x ngập bản gel (khoảng 1mm).
6. Dùng pipet cho tất cả các mẫu ựiện di (12ộl) vào giếng. Chú ý: luôn cho marker vào giếng ựầu tiên của bản gel và tránh ựể tràn mẫu.
7. Cắm nguồn ựiện cho máy ựiện di ở hiệu ựiện thế 100V trong 30 phút.
8. Sau khi ựã ựiện di, ựặt bản agarose lên máy soi gel (phát tia UV) và quan sát các băng DNA và so sánh với thang DNA ựể ựánh giá kết quả. Những mẫu nhiễm SRBSDV là những mẫu có thang DNA là 0,6 kb.
CHƯƠNG III
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Mô tả triệu chứng bệnh
Chẩn ựoán và phát hiện triệu chứng bệnh là cơ sở cần thiết trong nghiên cứu cũng như trong công tác bảo vệ thực vật. Chẩn ựoán bệnh cây nói chung và chẩn ựoán bệnh virus lùn sọc ựen phương Nam (SRBSDV) nói riêng có nhiều phương pháp khác nhau, trong ựó quan sát triệu chứng bệnh là phương pháp dễ thực hiện nhất.
Dựa trên những triệu chứng bệnh chúng tôi ựiều tra ngoài ựồng, từ những cây nhiễm bệnh các chi cục BVTV gửi ựến giám ựịnh và dựa trên triệu chứng trên cây lây nhiễm bệnh nhân tạo, chúng tôi ựã khái quát những triệu chứng bệnh ựiển hình nhất của virus lùn sọc ựen phương Nam.
*Trên cây lúa: cây lúa nhiễm virus có thể có một hoặc nhiều triệu chứng sau ựây: Cây thấp lùn, lá cứng, mọc xắt nhau, xuất hiện sọc trắng chạy dọc theo gân chắnh và bẹ lá, toàn cây xanh ựậm hơn bình thường, mép lá có nhiều vết nhăn ngang, xoắn ở ựầu lá hoặc toàn bộ lá, trắng mép lá và rách mép lá hình chữ V. Nếu cây nhiễm bệnh vào giai ựoạn có lóng thân, xuất hiện những nốt phồng mầu trắng chạy dọc thân, lúc ựầu có mầu trắng sau ựó chuyển sang mầu nâu ựến ựen (Hình 3.1; 3.2; 3.3; 3.4).
*Trên cây ngô: triệu chứng chung là cây thấp lùn, các lá cứng, mọc xắt nhau, xanh ựậm, một số lá xoắn và rách, ựặc trưng nhất là ở mặt sau lá có các u sần nổi gồ chạy dọc theo gân lá. U sần còn xuất hiện trên những lá bắp ở những cây ngô nhiễm bệnh muộn (Hình 3.5; 3.6). Cây ngô nhiễm bệnh ở giai ựoạn sớm có thể chết sau một thời gian, nhiễm vào giai ựoạn muộn cây vẫn có khả năng trỗ tuy nhiên bắp nhỏ, hạt lép, năng suất thấp.
Hình ảnh triệu chứng trên lúa
Hình 3.1. Sọc trắng chạy dọc gân chắnh Hình 3.2. Trắng mép lá và rách chữ V
Hình 3.3. Xoắn ngọn lá, xuất hiện nhăn ngang
Hình 3.4. Nốt phồng trắng chạy dọc thân
Hình ảnh triệu chứng trên ngô
Hình 3.5. Sọc trắng chạy dọc theo gân
3.2. Phân biệt triệu chứng do virus lùn sọc ựen phương Nam và virus lùn xoắn lá gây ra trên lúa xoắn lá gây ra trên lúa
Virus lùn sọc ựen phương Nam (SRBSDV) và virus lùn xoăn lá (RRSV) ựều thuộc họ Reoviridae. đặc ựiểm chung của họ virus Reoviridae là khi vào trong tế bào cây, virus sẽ kắch thắch những tế bào ở gân lá sinh sản quá ựộ, tạo nên những u sáp dọc theo gân chắnh và bẹ lá, ựồng thời chúng ức chế protein sản sinh ra phytohoocmon là Gibberellin trong cây làm cho cây có triệu chứng thấp lùn, lá cứng và xanh ựậm. Do vậy khi cây lúa nhiễm một trong hai loại virus trên, chúng gây ra những triệu chứng khá giống nhau và khó có thể phân biệt ựược bằng mắt thường. Dựa trên kết quả giám ựịnh virus trên lúa từ thu thập ựược ngoài ựồng ruộng và từ kết quả thắ nghiệm lây bệnh nhân tạo, chúng tôi ựã tiến hành so sánh triệu chứng ựặc trưng của bệnh lùn sọc ựen phương Nam với bệnh lùn xoắn lá nhằm phục vụ cho công tác ựiều tra và giám ựịnh bệnh virus trên lúa. Kết quả ựược trình bày ở bảng sau:
Bảng 3.1. So sánh những triệu chứng ựặc trưng của bệnh lùn sọc ựen phương Nam và bệnh lùn xoắn lá gây ra trên lúa
TT Triệu chứng chung Lùn sọc ựen
phương Nam Lùn xoắn lá
1 Cây thấp lùn, lá mọc xắt nhau Có Có
2 Lá cứng, xanh ựậm hơn bình thường Có Có
3 Sọc trắng chạy dọc gân chắnh và bẹ lá Có Có
4 Trắng mép lá, rách mép lá chữ V Có Có
5 Xoắn ngọn lá/ lá không thoát khỏi bẹ Có Có
6 Cây không trỗ bông/ trỗ bị nghẹn ựòng/ hạt
lép nhiều Có Có
7 Nốt phồng mầu trắng xuất hiên trên lóng
Hình 3.7. Sọc trắng chạy dọc gân chắnh và bẹ lá
Hình 3.8. Trắng mép lá và rách chữ V
Qua bảng 3.1 cho thấy triệu chứng của bệnh lùn sọc ựen phương Nam và lùn xoắn lá rất giống nhau. Hai loại bệnh này ựều tạo ra những triệu chứng ựặc trưng là cây thấp lùn, lá mọc xắt nhau, lá cứng, xanh ựậm hơn bình thường, trắng mép lá, rách chữ V, xoắn ngọn lá, lá không thoát khỏi bẹ lá, và ựặc biệt chúng ựều tạo ra những sọc mầu trắng chạy dọc theo gân chắnh và bẹ lá. Những nốt phồng này xuất hiền là do sự sản sinh và tăng kắch thước quá ựộ của những tế bào phloem của cây bệnh.
Tuy nhiên, có thể phân biệt ựược hai loại bệnh này ở giai ựoạn cây lúa ựã phát triển lóng thân, cây lúa nhiễm virus lùn sọc ựen phương Nam sẽ xuất hiện những nốt phồng mầu trắng chạy dọc theo lóng thân, sau một thời gian sẽ chuyển sang mầu ựen (hình 3.9). Trong khi ựó, những cây nhiễm virus lùn xoăn lá không gây ra triệu chứng trên (hình 3.10). Nguyên nhân là do mối quan hệ giữa virus và tế bào cây kắ chủ. Virus lùn xoắn lá (RRSV) chỉ tồn tại và nhân lên trong tế bào chất của tế bào nhu mô pholoem và tế bào mạch rây ở gân lá, và luôn luôn ựược giữ trong viroplasms hình sợi nhỏ. Virus không ựược tìm thấy ở bất cứ nơi nào khác trong cây nhiễm bệnh (Shikata E, 1966). Trong khi ựó, virus lùn sọc ựen phương Nam (SRBSDV) có thể di chuyển khắp hệ thống mạch dẫn trong cây và có xu hướng di chuyển xuống phần thân và rễ, chắnh vì thế loài virus này có thể gây ra những u sần ở phần lóng thân của cây nhiễm bệnh.
Do sự giống nhau về triệu chứng gây bệnh, vì thế ựể giám ựịnh ựược bệnh lùn sọc ựen phương Nam một cách chắnh xác nhất và nhanh nhất cần sử dụng những phương pháp giám ựịnh hiện ựại như ELISA, RT-PCR.
3.3. Phổ ký chủ của virus lùn sọc ựen phương Nam
Chúng tôi ựã thu thập các mẫu cỏ một cách ngẫu nhiên ở trong hoặc xung quanh bờ của ruộng lúa, ngô bị bệnh nhiễm bệnh virus lùn sọc ựen phương Nam và tiến hành kiểm tra sự có mặt có virus lùn sọc ựen phương
Nam trong các mẫu cỏ này bằng phương pháp RT-PCR trong phòng thắ nghiệm. Kết quả ựược trình bầy ở bảng 3.2:
Bảng 3.2. Kết quả giám ựịnh các mẫu cỏ thu thập ngoài ựồng ruộng tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam
Ký chủ T
T địa ựiểm
thu mẫu Tên Việt
Nam Tên khoa học Triệu chứng
Kết quả RT- PCR
1 điện Biên Cỏ tranh Imperat cylindrica Lá nhăn, xoắn
ựầu lá - Cỏ lồng vực nước Echinochloa crusgalli Không triệu chứng - 2 Sơn La Cỏ lồng vực cạn Echinochloa colonum Xoắn mép lá, phiến lá nhăn nheo - Cỏ lồng vực nước Echinochloa crusgalli Nhăn mép lá, sọc trắng trên gân và mặt sau lá + Cỏ lồng vực cạn Echinochloa colonum Nhăn mép lá - 3 Thái Bình
Cỏ lác dù Cyperus difformis Không triệu
chứng - Cỏ lồng vực cạn Echinochloa colonum Không triệu chứng - 4 Ninh Bình Cỏ lồng vực nước Echinochloa crusgalli Nhăn mép lá, lá xanh ựậm - Cỏ lá tre Axonopus compressus Không triệu chứng - 5 Thanh Hoá
Cỏ mần trầu Eleusine indica Lá nhăn, cây
thấp lùn +
Tổng 10 mẫu
Kết quả ở bảng 3.2 cho thấy, trong số 10 mẫu (06 loài cỏ) thu thập tại 05 tỉnh tại miền Bắc ựã có 02 mẫu cho kết quả dương tắnh với virus gây bệnh lùn sọc ựen phương Nam, bao gồm 01 mẫu cỏ lồng vực nước (Echinochloa crusgalli) thu gần ruộng lúa bị nhiễm bệnh tại tỉnh Thái Bình có triệu chứng khá giống với cây lúa nhiễm bệnh là cây thấp, lùn, nhăn mép lá, xuất hiện
những sọc trắng trên gân và mặt sau lá (Hình 3.11) và 01 mẫu cỏ mần trầu (Eleusine indica) thu tại ruộng ngô ở tỉnh Thanh Hoá với triệu chứng lá nhăn và cây thấp lùn, lá xanh ựậm hơn bình thường (Hình 3.12). Các mẫu cỏ còn lại ựều cho kết quả âm tắnh.
Hình 3.11. Cỏ lồng vực nước nhiễm SRBSDV CC MT LVC LD CT LVN LVC M Ghi chú: LD: Cỏ lác dù CC: Cỏ chỉ CT: Cỏ tranh LVN: Cỏ lồng vực nước MT: Cỏ mần trầu LVC: Cỏ lồng vực cạn M: Marker Hình 3.12. Cỏ mần trầu nhiễm SRBSDV Hình 3.13. Kết quả giám ựịnh RT-PCR
Song song với việc ựiều tra, thu thập và xác ựịnh ký chủ phụ của virus lùn sọc ựen phương Nam ở ngoài tự nhiên, chúng tôi ựã dựa vào danh sách phổ ký chủ của rầy lưng trắng (Sogatella furcifera) do CABI cung cấp ựể tiến hành lây bệnh nhân tạo nhằm xác ựịnh khả năng lan truyền của virus lùn sọc ựen phương Nam từ lúa sang cỏ dại thông qua môi giới là rầy lưng trắng,
ựồng thời bổ sung thêm về phổ ký chủ của loài virus này. Bước ựầu chúng tôi ựã tiến hành lây bệnh nhân tạo trên 10 loài cỏ là: cỏ chân vịt, cỏ chỉ lớn, cỏ ựuôi phượng, cỏ lục lông, cỏ lồng vực cạn, cỏ lồng vực nước, cỏ lác dù, cỏ may, cỏ mật và cao lương. Kết quả ựược trình bầy ở bảng 3.3:
Từ kết quả ở bảng 3.3 cho nhận thấy trong số 10 loài cỏ thắ nghiệm ựã xác ựịnh ựược 03 loài cỏ bị nhiễm virus lùn sọc ựen phương Nam, bao gồm: cỏ ựuôi phượng, cỏ lồng vực nước và cỏ lục lông. Trong số 03 loài cỏ này, chỉ có 02 loài cỏ là cỏ lồng vực nước và cỏ lục lông biểu hiện những triệu chứng ựiển hình trên cây nhiễm bệnh: cây thấp lùn, lá xanh ựậm hơn bình thường, xuất hiện những vết nhăn trên mép và phiến lá và mép lá rách hình chữ V (hình 3.14; 3.15). Trong khi ựó, loài cỏ ựuôi phượng khi nhiễm virus lùn sọc ựen phương Nam không biểu hiện bất kỳ triệu chứng bệnh nào, cây bị bệnh vẫn sinh trưởng và phát triển bình thường (hình 3.16).
Tỷ lệ cây nhiễm bệnh và thời gian tiềm dục ở mỗi loài cỏ là khác nhau. Cỏ lục lông có tỷ lệ nhiễm bệnh cao nhất lên ựến 50%, tỷ lệ cỏ lồng vực nước