NGHIÊN CỨU
3.1. đối tượng và vật liệu nghiên cứu
3.1.1. đối tượng
Hai giống hoa hồng có nguồn gốc ựịa phương.
STT Tên giống đặc ựiểm thực vật học
1 Hồng Cơm Phú Thọ
Cây bụi thấp, cành và lá nhỏ, xanh ựậm. Hoa cánh kép, màu hồng ựậm.
2 Hồng Nhung đà Bắc Hịa Bình
Cây bụi thấp, lá nhỏ, xanh ựậm. Hoa cánh ựơn, màu ựỏ.
(Nguồn giống: do tiến sỹ Nguyễn Mai Thơm, Bộ môn Canh tác học, Khoa Nông học, Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội cung cấp)
3.1.2. Vật liệu
Các chồi in vitro của 2 giống trên ựược duy trì trên mơi trường MS + 0,05 mg/l α-NAA + 1,5 mg/l BA + 30g/l sucrose
3.2. địa ựiểm, ựiều kiện thắ nghiệm và thời gian nghiên cứu
Các thắ nghiệm trong phịng ựược bố trắ tại phịng Cơng nghệ Sinh học Thực vật, Khoa Công nghệ Sinh học, Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội.
+ Cường ựộ chiếu sáng 2000 Ờ 3000 lux + Thời gian chiếu sáng: 16h/ngày
+ Nhiệt ựộ phịng ni: 22-250 c
3.2.1. Thời gian nghiên cứu.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 37
3.3. Nội dung và phương pháp nghiên cứu 3.3.1. Nội dung 3.3.1. Nội dung
Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố ựến quá trình ra hoa in vitro của 2 giống hoa hồng ựịa phương là: hồng Nhung đà Bắc Hịa Bình, và giống hồng Cơm Phú Thọ, bao gồm 8 thắ nghiệm
3.3.1.1. Thắ nghiệm 1: Ảnh hưởng của hàm lượng ựường ựến sự ra hoa in vitro vitro
Thắ nghiệm ảnh hưởng của hàm lượng ựường ựến sự ra hoa in vitro
của cây hoa hồng ựược bố trắ trên giống hoa hồng Cơm Phú Thọ, trên nền môi trường MS + 7g/l Agar có PH=5,7, có bổ sung các chất ựiều tiết sinh trưởng. Các công thức khác nhau bởi sự bổ sung hàm lượng ựường khác nhau. Các chồi ựơn ựược chọn ựể bố trắ thắ nghiệm là những mẫu chồi to, khỏe, ựồng ựều nhau có kắch thước 1,5 tới 2cm.
Môi trường nền: MS + B5 + 2mg/l BA - CT1: MS + B5 + 2mg/l BA (đC) - CT2: MS + B5 + 2mg/l BA + 20g/l sucrose - CT3: MS + B5 + 2mg/l BA + 40g/l sucrose - CT4: MS + B5 + 2mg/l BA + 60g/l sucrose - CT5: MS + B5 + 2mg/l BA + 80g/l sucrose
3.3.1.2. Thắ nghiệm 2: Ảnh hưởng của GA3 ựến quá trình ra hoa in vitro
Thắ nghiệm tìm hiểu ảnh hưởng của GA3 ựến sự ra hoa của cây hoa hồng in vitro ựược bố trắ trên giống Nhung đà Bắc Hịa Bình trên nền mơi trường MS + 7g/l Agar có PH=5,7, có bổ sung GA3. Các công thức khác nhau bởi sự bổ sung hàm lượng GA3 khác nhau. Các chồi ựơn ựược chọn ựể bố trắ thắ nghiệm là những mẫu chồi to, khỏe, ựồng ựều nhau có kắch thước 1,5 tới 2cm. Môi trường nền: MS + 30g/l ựường + B5 + 2mg/l BA + 0.05mg/l NAA
- CT1: Môi trường nền (đC)
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 38 - CT3: Môi trường nền + 0.25mg/l GA3
- CT4: Môi trường nền + 0.5mg/l GA3 - CT5: Môi trường nền + 1mg/l GA3
3.3.1.3. Thắ nghiệm 3: Ảnh hưởng của paclobutazol (PBZ) ựến sự hình thành hoa in vitro thành hoa in vitro
Thắ nghiệm tìm hiểu ảnh hưởng của PBZ ựến sự ra hoa của cây hoa hồng in vitro ựược bố trắ trên giống Cơm Phú Thọ trên nền môi trường MS + 7g/l Agar có PH=5,7, có bổ sung Paclabutrazol. Các cơng thức khác nhau bởi sự bổ sung hàm lượng PBZ khác nhau. Các chồi ựơn ựược chọn ựể bố trắ thắ nghiệm là những mẫu chồi to, khỏe, ựồng ựều nhau có kắch thước 1,5 tới 2cm.
- CT1: MS (đC)
- CT2: MS + 0,025mg/l PBZ - CT3: MS + 0,05mg/l PBZ - CT4: MS + 0,075mg/l PBZ - CT5: MS + 0,1mg/l PBZ
3.3.1.4.Thắ nghiệm 4: Ảnh hưởng của AgNO3 ựến sự hình thành hoa in vitro
Thắ nghiệm tìm hiểu ảnh hưởng của AgNo3 ựến sự ra hoa của cây hoa hồng in vitro ựược bố trắ trên 2 giống giống Cơm Phú Thọ và giống Nhung đà Bắc Hịa Bình trên nền mơi trường MS + 7g/l Agar có PH=5,7, có bổ sung AgNo3. Các công thức khác nhau bởi sự bổ sung hàm lượng AgNo3 khác nhau. Các chồi ựơn ựược chọn ựể bố trắ thắ nghiệm là những mẫu chồi to, khỏe, ựồng ựều nhau có kắch thước 1,5 tới 2cm.
- CT1: MS (đC)
- CT2: MS + 10 ộM AgNO3 - CT3: MS + 20 ộM AgNO3 - CT4: MS + 30 ộM AgNO3 - CT5: MS + 40 ộM AgNO3
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 39 - CT6: MS + 50 ộM AgNO3
3.3.1.5. Thắ nghiệm 5: Ảnh hưởng của CoCl2 ựến sự hình thành hoa in vitro vitro
Thắ nghiệm tìm hiểu ảnh hưởng của CoCl2 ựến sự ra hoa của cây hoa hồng in vitro ựược bố trắ trên 2 giống giống Cơm Phú Thọ và giống Nhung đà Bắc Hịa Bình trên nền mơi trường MS + 7g/l Agar có PH=5,7, có bổ sung Cobancolorua. Các cơng thức khác nhau bởi sự bổ sung hàm lượng CoCl2 khác nhau. Các chồi ựơn ựược chọn ựể bố trắ thắ nghiệm là những mẫu chồi to, khỏe, ựồng ựều nhau có kắch thước 1,5 tới 2cm.
- CT1: MS (đC) - CT2: MS + 10 ộM CoCl2 - CT3: MS + 20 ộM CoCl2 - CT4: MS + 30 ộM CoCl2 - CT5: MS + 40 ộM CoCl2 - CT6: MS + 50 ộM CoCl2
3.3.1.6. Thắ nghiệm 6: Ảnh hưởng của chồi ựơn và cụm chồi ựến sự hình thành hoa in vitro thành hoa in vitro
Thắ nghiệm tìm hiểu ảnh hưởng của cụm chồi và chồi ựơn ựến sự ra hoa của cây hoa hồng in vitro ựược bố trắ trên Giống Nhung đà Bắc Hịa Bình, trên nền mơi trường MS + 7g/l Agar có PH=5,7, có bổ sung nồng ựộ AgNo3 tối ưu cho sự cảm ứng ra hoa rút ra từ thắ nghiệm tìm hiểu ảnh hưởng của AgNo3 tới sự ra hoa in vitro cây hoa hồng. Các chồi ựơn và cụm chồi ựược chọn ựể bố trắ thắ nghiệm là những mẫu chồi to, khỏe, ựồng ựều nhau có kắch thước các chồi ựơn 1,5 tới 2 cm.
- CT1: Chồi ựơn - CT2: Cụm chồi
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 40
3.3.1.7. Thắ nghiệm 7: Ảnh hưởng của số lần cấy chuyển ựến sự hình thành hoa in vitro thành hoa in vitro
Thắ nghiệm tìm hiểu ảnh hưởng của số lần cấy chuyển ựến sự ra hoa của cây hoa hồng in vitro ựược bố trắ trên Giống Cơm Phú Thọ trên nền môi trường MS + 7g/l Agar có PH=5,7. Các chồi ựơn ựược chọn ựể bố trắ thắ nghiệm là những mẫu chồi to, khỏe, ựồng ựều nhau có kắch thước 1,5 tới 2cm.
- CT1: Cấy chuyển 2 lần - CT2: Cấy chuyển 3 lần - CT3: Cấy chuyển 4 lần - CT4: Cấy chuyển 5 lần
3.3.1.8. Thắ Nghiệm 8: ảnh hưởng của stress hạn bằng PEG ựến sự ra hoa in vitro in vitro
Thắ nghiệm tìm hiểu ảnh hưởng của PEG ựến sự ra hoa của cây hoa hồng in vitro ựược bố trắ trên Giống Nhung đà Bắc Hịa Bình trên nền mơi trường MS + 7g/l Agar có PH=5,7, có bổ sung PEG. Các cơng thức khác nhau bởi sự bổ sung hàm lượng PEG khác nhau. Polyethylene glycol ựược bổ sung vào
trong môi trường MS nhằm tạo ra 1 áp suất thẩm thấu gây ra stress hạn cho cây ựược cấy trong mơi trường ựó. PEG ựược hòa tan vào nước theo tỷ lệ nhất ựịnh tùy từng cơng thức, sau ựó dung dịch PEG này ựược cho vào hấp khử trùng trong nồi hấp. Môi trường MS ựược chuẩn bị với hàm lượng Agar ựược bổ sung lớn hơn so với thông thường (7,2 g/l) sau ựó mang hấp khử trùng trong nồi hấp ở 1200 c trong thời gian 20 phút. Môi trường MS sau khi hấp xong ựược ựể nguội tạo môi trường thạch trong thời gian 24 tiếng. Dung dịch PEG sau khi ựược hấp khử trùng ở 1200c trong thời gian 20 phút ựược ựể nguội sau ựó ựược bổ sung vào trong mơi trường MS thạch ựã ựược hấp khử trùng, sau khi dung dịch PEG ựược bổ sung vào môi trường MS, 24h ựể các phân tử Polyethylene glycol thẩm thấu vào môi trường MS thạch, lượng nước thừa cịn lại ựược chắt bỏ hồn tồn ra ngồi. Tất cả các cơng ựoạn này ựược
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 41 thực hiện trong Bốc cấy vô trùng. Các chồi ựơn ựược chọn ựể bố trắ thắ nghiệm là những mẫu chồi to, khỏe, ựồng ựều nhau có kắch thước 1,5 tới 2cm.