3. Nội dung nghiên cứu
3.7.4.Kết quả xác định trình tự gen mã hóa riboxom16S
Sau khi tinh sạch plasmid tái tổ hợp, đoạn DNA chèn vào plasmid đƣợc giải trình tự nucleotide theo nguyên lý của phƣơng pháp Sanger cải tiến dựa trên các dideoxy. DNA polymerase xúc tác gắn các dideoxynucleotide vào đầu 3'-OH mạch đơn DNA đang tổng hợp, quá trình tổng hợp sẽ dừng lại khi gặp dideoxynucleotide đánh dấu huỳnh quang không có nhóm 3'-OH. Kết quả là hỗn hợp sản phẩm sau phản ứng bao gồm các polynucleotide có kích thƣớc hơn kém nhau một nucleotide và đƣợc phát hiện bằng mẫu dò huỳnh quang trên máy đọc trình tự tự động ABI
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer. Vector pJET1.2 đƣợc gắn hai trình tự mồi xuôi và mồi ngƣợc M13 (-20) để đọc trình tự phân đoạn chèn DNA ngoại lai.
Kết quả đọc trình tự đƣợc phân tích, xử lý bằng phần mềm DNA Star để so sánh trình tự nucleotide, tính khoảng cách di truyền và xây dựng cây phân loại.
P
Phhâânnllooạạiicchhủủnnggvviikkhhuuẩẩnnpphhâânnllậậpp
Plasmid tái tổ hợp mang đoạn gen mong muốn đã đƣợc tách và tinh sạch bằng kit QIAGEN để đọc trình tự nucleotide. Đoạn gen mã hóa riboxom 16S của chủng vi khuẩn phân lập đƣợc xác định trình tự nucleotide trên máy giải trình tự tự động ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer. Sau khi phân tích và xử lý số liệu, nhận đƣợc đoạn gen của chủng G82 dài 1,5 kb, chủng G897 dài 1,0 kb. Trình tự đoạn gen này đƣợc so sánhvới trình tự đoạn gen mã hóa riboxom 16S của các chủng E. coli đã công bố trên GenBank bằng phần mềm DNAstar. Kết quả cho thấy chủng vi khuẩn phân lập G82 có quan hệ họ hàng gần gũi với một số đại diện thuộc chi Escherichia. Trong đó, có độ tƣơng đồng 98,1% với chủng 4GAQ: E. coli K12 và JX290090.1: E. coli KVP 110. Chủng vi khuẩn phân lập còn lại G897 có mức tƣơng đồng 100% so với các chủng JX267124.1: E. coli 112 và 4GAQ: E. coli K12 (Hình 3.6.).
Hình 3.6. Cây phát sinh chủng loại
G82: E. coli phân lập, JX290090.1: E. coli KVP 110, 4GAQ: E. coli K12, JX267124.1: E. coli 112, G897: E. coli phân lập, CP003301.1: E. coli O104: H4;
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN
1. Trong số 86 mẫu thịt nghiên cứu có 68,6 % mẫu nhiễm E. coli, số mẫu không đạt tiêu chuẩn chiếm 38,4 %. Mức độ nhiễm trung bình dao động từ 73 CFU/g đến 5,7x102 CFU/g.
2. Các chủng E. coli phân lập mẫn cảm cao nhất với kháng sinh Amikacin (95%).
3. Trong số 30 chủng vi khuẩn E. coli phân lập, đƣợc xác định type huyết thanh kháng nguyên O cho thấy: Có 5 chủng thuộc nhóm O26 là một trong số các type huyết thanh đã đƣợc xác định gây ra các bệnh ngộ độc và các chứng ngộ độc thực phẩm trên ngƣời.
4. Sử dụng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu để tìm gen VT1 và VT2 gây
ngộ độc thực phẩm của 5 chủng E. coli phân lập nhƣng không cho kết quả dƣơng tính.
5. Hai chủng vi khuẩn phân lập G82, G897 đƣợc định tên bằng việc giải trình tự
đoạn gen mã hóa riboxom16S thấy rằng: Chủng G82 có quan hệ gần gũi với chủng 4GAQ: E. coli K12 và JX290090.1: E. coli KVP 110, với độ tƣơng đồng 98,1%. Chủng G897 có mức tƣơng đồng 100% so với các chủng JX267124.1: E. coli 112 và 4GAQ: E. coli K12.
KIẾN NGHỊ
Cần tiến hành nghiên cứu thêm về E. coli ( tìm thêm gen có nguy cơ gây ngộ độc khác nhƣ ST1, ST2...phân lập và xác định sự có mặt của E. coli O157:H7...khu vực Thái Nguyên).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
PHỤ LỤC ẢNH
Hình 1. Hình ảnh E. coli trong phản ứng lên men đƣờng trên môi trƣờng TSI
Hình 2. Hình ảnh E. coli trong phản ứng sinh Indol
Hình 3. Hình ảnh khuẩn lạc E. coli sau khi ria cấy
Hình 4. Hình ảnh khuẩn lạc E. coli
trong phƣơng pháp định lƣợng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
khuyếch tán trên môi trƣờng của E. Coli
PHỤ LỤC 1 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Dịch pha loãng, môi trường nuôi cấy và thuốc thử - Dịch pha loãng (nƣớc muối sinh lý 8,5%):
Nacl 8,5g
Nƣớc cất 1000ml
- Môi trường nuôi cấy
+ Môi trường thạch Macconkey
Peptone 20g
Lactose 10g
Bile Salts #3 (Hỗn hợp muối mật) 1,5g
Sodium chloride 5g
Neutral red 0,030g
Crystal violet 0,001g
Agar 15g
+ Nước thịt Nutrient broth
Meat peptone 5g
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
+Thuốc thử: Thuốc thƣ̉ Kovac để thƣ̉ indol
Cồn Isoamyl 150ml
Paradimethylamino bensaldehyt 10g
HCL đặc 50ml
Pha chế: Hòa aldehyt trong cồn , sau đó cho tƣ̀ tƣ̀ axit vào . Thuốc thƣ̉ này cần giƣ̃
trong tủ lạnh, tránh ánh sáng. - Thạch TSI Meat extract 3,0 g Yeast extract 3,0 g Peptone 20,0 g Sodium chloride 5,0 g Lactose 10,0 g Sucrose 10,0 g Glucose 1,0 g Ferri citrate 0,3 g Sodium thiosulphate 0,3 g Phenol red 0,024 g Agar 12,0 g Nƣớc cất 1000,0 ml
Điều chỉnh pH tới 7,4; phân ra các ống nghiệm, mỗi ống 10 ml. Tiệt khuẩn 10 phút ở 1210C, để nghiêng phần thạch ở đáy ống cao 2,5 cm.
- Môi trƣờng LB (Luria-Bertani):
1% (w/v) peptone; 0,5% (w/v) cao nấm men; 1% (w/v) NaCl; pH 7,0-7,5, khử trùng, đối với môi trƣờng LB đặc có bổ sung 1,5% (w/v) agar. Để chọn lọc chủng mang plasmid tái tổ hợp, môi trƣờng đƣợc bổ sung 50 µg/ml ampicillin.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
PHỤ LỤC 2
Trình tự gen mã hóa riboxom 16S của chủng G897
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
LỜI CẢM ƠN
Trƣớc hết tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới TS. Vũ Văn Hạnh, Phó Trƣởng phòng, Phụ trách phòng Các chất chức năng sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học & Công nghệ Việt Nam đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ bảo, động viên và tạo điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tôi xin chân thành cảm ơn PGS. TS. Đặng Xuân Bình, Giám đốc Trung tâm Liên kết Đào tạo Quốc tế - Trƣờng Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, Trƣởng Bộ môn Công nghệ vi sinh - Viện Khoa học sự sống – Đại học Thái Nguyên, đã tận tình giúp đỡ tạo điều kiện thuân lợi, truyền đạt kinh nghiệm và hỗ trợ tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Khoa học Sự sống - Đại học Thái Nguyên; Ban Lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học - Viện Khoa học & Công nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận văn này.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Khoa Khoa học sự sống, trƣờng Đại học Khoa học Thái Nguyên, các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên, cùng toàn thể đồng nghiệp đã tận tình giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này.
Tôi cũng xin bày tỏ lời cảm ơn đến bạn bè, gia đình và ngƣời thân đã luôn bên tôi, khuyến khích, động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn.
Thái Nguyên, tháng 09 năm 2012 Tác giả luận văn
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
BẢNG CHỮ VIẾT TẮT
VSATTP Vệ sinh an toàn thực phẩm
E. coli Escherichia coli
NĐTP Ngộ độc thực phẩm
Cs Cộng sự
HACCP Hazard Analysis and Critical Control Point (Phân tích mối nguy và điểm kiểm soát tới hạn)
QĐ-BYT Quyết định- Bộ Y tế
QPPL Quy phạm pháp luật
SXKD Sản xuất kinh doanh
TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam
WHO World Health Oganization (Tổ chức Y tế Thế giới )
KIT Bộ sinh phẩm chẩn đoán
PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp)
EtBr Ethydium bromide
LB Luria- Broth
IMViC Indol – Methyl Red – Voges, Proskauer - Citrat NEB Native Elution Buffer (Dung dich rửa giải)
CFU Colony Forming Unit (Đơn vị hình thành khuẩn lạc) ELISA Phản ứng miễn dịch học gắn enzyme
OD Optical density (Mật độ quang)
ONPG Ortho-nitrophenyl-D-galactopyranoside
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ... 1
1. Đặt vấn đề ... 2
2. Mục tiêu nghiên cứu ... 3 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3. Nội dung nghiên cứu ... 3
CHƢƠNG 1TỔNG QUAN TÀI LIỆU ... 4
1.1. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ THỊT ... 4
1.1.1. Đặc tính chung của thịt ... 4
1.1.2. Thành phần hóa học của thịt ... 4
1.1.3. Các nguyên nhân gây hƣ hỏng thịt ... 6
1.2. VI KHUẨN GÂY NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM ... 8
1.2.1. Ngộ độc thực phẩm ... 8
1.2.2. Nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm ... 8
1.2.3. Một số vi khuẩn phân lập đƣợc từ thịt gây ngộ độc thực phẩm ... 9
1.2.4. Tình hình ngộ độc thực phẩm ở Việt Nam và trên thế giới ... 12
1.3. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI (E. COLI ) ... 14
1.3.1. Lịch sử nghiên cứu ... 14
1.3.2. Phân loại ... 14
1.3.3. Đặc điểm hình thái, cấu trúc của vi khuẩn E. coli ... 15
1.3.4. Đặc tính nuôi cấy, đặc điểm sinh hóa ... 16
1.3.5. Đặc tính gây bệnh của vi khuẩn E. coli... 17
1.4. PHƢƠNG PHÁP HIỆN ĐẠI PHÁT HIỆN E. COLI TRONG THỰC PHẨM . 18 1.4.1. Phƣơng pháp PCR (polymerase Chain Reaction) ... 18
1.4.2. Phƣơng pháp ELISA ... 19
1.4.3. Phát hiện E. coli bằng phức hợp kháng thể, hạt nano silica phát quang ... 22
CHƢƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ... 23
2.1. VẬT LIỆU ... 23
2.1.1. Mẫu nghiên cứu ... 23
2.1.2. Môi trƣờng, nguyên liệu, hóa chất ... 23
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... 26
2.3.1. Phƣơng pháp lấy mẫu xét nghiệm ... 26
2.3.2. Phƣơng pháp xác định chỉ tiêu vi khuẩn E. coli trong thịt lợn tƣơi ... 26
2.3.3. Xác định tính mẫn cảm của các chủng vi khuẩn E. coli phân lập đối với một số loại thuốc kháng sinh. ... 28
2.3.4. Phƣơng pháp tiến hành phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính (xác định type huyết thanh) ... 29 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.3.5. Xác định gen VT1, VT2 của các chủng E. coli bằng phản ứng PCR ... 30
2.3.6. Nghiên cứu đặc điểm di truyền bằng nhân dòng đọc trình tự đoạn gen mã hóa riboxom 16S từ E. coli ... 31
2.3.7. Phƣơng pháp xử lý số liệu ... 35
CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ... 36
3.1. Khảo sát tình hình giết mổ và tiêu thụ thịt lợn trên địa bàn thành phố Thái Nguyên 36 3.2. Mức độ nhiễm vi khuẩn E. coli trên thịt lợn tƣơi. ... 37
3.3. Kết quả nghiên cứu một số đặc điểm sinh học, hóa học của vi khuẩn E. coli... 38
3.4. Kết quả xác định tính mẫn cảm kháng sinh ... 39
3.5. Kết quả xác định type huyết thanh của một số chủng E. coli phân lập đƣợc ... 40
3.6. Kết quả xác định gen gây ngộ độc thực phẩm bằng PCR ... 41
3.7. Kết quả định danh vi khuẩn phân lập bằng đọc trình tự gen mã hóa riboxom 16S .. 42
3.7.1. Tách chiết DNA tổng số ... 42
3.7.2. Kết quả nhân gen mã hóa riboxom 16S bằng PCR ... 43
3.7.3. Kết quả tách dòng gen mã hóa riboxom 16S ... 44
3.7.4. Kết quả xác định trình tự gen mã hóa riboxom 16S ... 44
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ... 46 KẾT LUẬN ... 46 KIẾN NGHỊ ... 46 PHỤ LỤC ẢNH PHỤ LỤC 1 PHỤ LỤC 2
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Đánh giá cảm quan thịt ... 5 Bảng 1.2. Tiêu chuẩn đánh giá thịt tƣơi bằng các phản ứng sinh hóa học ... 6 Bảng 2.1. Các thiết bị đƣợc sử dụng trong thí nghiệm ... 25 Bảng 3.1. Kết quả khảo sát tình hình giết mổ và tiêu thụ thịt lợn trên địa bàn thành phố Thái Nguyên ... 36 Bảng 3.2. Kết quả xác định vi khuẩn E. coli nhiễm trên thịt lợn tƣơi ... 37 Bảng 3.3. Kết quả giám định một số đặc tính sinh hóa của vi khuẩn E. coli phân lập đƣợc ... 38 Bảng 3.4. Kếtquả xác định tính mẫn cảm của vi khuẩn E. coli phân lập đối với một số loại kháng sinh ... 39 Bảng 3.5. Kết quả xác định type huyết thanh kháng nguyên O của chủng vi khuẩn
E. coli phân lập đƣợc ... 41 Bảng 3.6. Tỷ lệ các chủng vi khuẩn E. coli mang gen gây ngộ độc ... 42
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
DANH MỤC HÌNH
Sơ đồ 2.1. Phân lập E. coli từ thịt ... 27
Hình 3.1. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR xác định gen VT1, VT2 ... 42
Hình 3.2. Hình ảnh điện di sản phẩm DNA tổng số ... 43
Hình 3.3. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR từ gen mã hóa riboxom 16S ... 43
Hình 3.4. Hình ảnh điện di sản phẩm plasmid ... 44
Hình 3.5. Hình ảnh điện di sản phẩm cắt vector tái tổ hợp bằng XhoI và XbaI ... 44