3. Nội dung nghiên cứu
2.3.2.Phƣơng pháp xác định chỉ tiêu vi khuẩn E.coli trong thịt lợn tƣơi
Xác định chỉ tiêu vi khuẩn E. coli trong thịt tƣơi áp dụng theo TCVN 5155:1990 [4], [15], [24].
- Đồng nhất và pha loãng mẫu: Cân 10g thịt tƣơi (không lấy mỡ) nghiền nát trong cối sứ, nghiền tiếp bằng máy xay thịt, cho vào bình tam giác 100 ml, bổ sung 90 ml dịch dinh dƣỡng Nutrient Broth, đƣợc độ pha loãng 10-1. Ly tâm 3000 vòng/phút trong 30 phút, tiếp tục pha loãng đến mức không còn khả năng dƣơng tính (10-6,10-7).
- Cấy dàn trên thạch Macconkey, mỗi độ pha loãng cấy trên 2 đĩa thạch khác nhau, ủ ở 37oC trong 24 giờ.
- Đếm số khuẩn lạc đƣợc nghi là E. coli (dạng S, bề mặt vồng, rìa gọn, tròn, màu đỏ cánh sen, xung quanh có vùng mờ sƣơng). Những đĩa thạch sau khi cấy với 0,1 ml dịch mẫu nghiền đã pha loãng ủ ở 37oC trong 24 giờ có ít nhất 30 khuẩn lạc và không vƣợt quá 300 khuẩn lạc mới đƣợc chấp nhận. Tính kết quả theo Quinn.P.J [44].
- Trên mỗi đĩa thạch, chọn ít nhất 5 khuẩn lạc đồng nhất nghi là E. coli đƣợc giám định đặc điểm hình thái và sinh hoá: Kiểm tra hình thái, kích thƣớc (0,3-0,6 x 2-3 m), tính chất bắt màu Gram (-), phản ứng sinh Indol 44,5oC(+), H2S, urease (- ), MR dƣơng tính, VP (-), Citrate (-). Giám định type huyết thanh kháng nguyên O. Xác định khả năng sản sinh độc tố, độc lực…
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Sơ đồ 2.1. Phân lập E. coli từ thịt
Mẫu thịt Thạch máu, ủ ở 37oC/ 24-48 giờ Thạch MacConkey, ủ ở 37oC/24-48 giờ Thạch máu, Thạch MacConkey Tủ ấm 370
C/24-48h (để tạo giống thuần) Chọn khuẩn lạc quan tâm nghi ngờ là E. coli
Kiểm tra hình thái vi khuẩn
Kiểm tra đặc tính sinh hóa (Sinh Indol – lên men đƣờng
-di động – H2S…) Giữ giống Xác định các yếu tố gây bệnh Xác định khả năng mẫn cảm với kháng sinh E.coli
Xác định type huyết thanh bằng phản ứng ngƣng kết
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn