Nghiên cứu đặc điểm di truyền bằng nhân dòng đọc trình tự đoạn gen mã

3. Nội dung nghiên cứu

2.3.6.Nghiên cứu đặc điểm di truyền bằng nhân dòng đọc trình tự đoạn gen mã

* Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số

Tế bào vi khuẩn E. coli đƣợc nuôi cấy trong 5 ml môi trƣờng LB qua đêm ở 37C, lắc 200 vòng/phút. Dịch nuôi đƣợc ly tâm 5 phút với 8.000 vòng/phút, thu cặn tế bào. Bổ sung vào cặn tế bào 300 μl lysis solution (2% trixton X100; 1% SDS; 100mM NaCl; 10mM EDTA), búng nhẹ cho tan, bổ sung 5 μl protease K. Hỗn hợp đƣợc ủ 2 giờ ở 56C, hạ đến nhiệt độ phòng, sau đó bổ sung tiếp 3 μl RNase, ủ trong 1 giờ ở 37C.Tiếp theo bổ sung 350 μl 7,5M CH3COONH4 trộn đều, ủ trong đá 15 phút để tủa protein, ly tâm 10 phút với 13.000 vòng/phút. Dịch trong đƣợc hút sang ống mới thu dịch trong sang ống mới, bổ sung tiếp 900 μl chloroform: isoamyl (24:1) lắc kĩ, ly tâm 10 phút với 12.000 vòng/phút. Tủa DNA bằng cách bổ sung thêm 700 μl isopropanol vào dịch trong thu đƣợc, ủ 1 giờ ở -20oC, ly tâm 10

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

phút với 13.000 vòng/phút. Tủa đƣợc rửa với ethanol 70%, ly tâm thu tủa, để khô. Sau khi tủa khô, thêm 30 μl TE, điện di kiểm tra [48].

* Phương pháp nhân gen mã hóa riboxom RNA 16S của E. coli bằng PCR

DNA tổng số đƣợc tinh sạch bằng kit thôi gel và sử dụng để nhân đoạn gen mã hóa riboxom16S của E. coli bằng PCR.

- Trình tự mồi được sử dụng để nhân đoạn gen mã hóa riboxom 16S

Mồi 27F/1492R tách DNA độ dài 1500bp

Tên mồi Trình tự mồi (5’-3’)

27F AGAGTTTGATCMTGGCTCAG

1492R GGTTACCTTGTTACGACTT

Mồi 9F/296R tách DNA độ dài 1000 bp

Tên mồi Trình tự mồi (5’-3’)

9F AGAGTTTGATCCTGGCTCAG

296 R CCGTCAAATTCCTTTRAGTTT - Điều kiện PCR

Nhiệt độ gắn mồi của 2 cặp mồi là là 47°C. Hỗn hợp phản ứng PCR (với tổng thể tích là 25 μl) bao gồm: 2,5 μl đệm PCR; 1,5 μl 25mM MgCl2; 2,0 μl 2,5mM dNTP; 1,0 μl DNA khuôn; 15,75μl nƣớc cất; 1,0 μl mồi mỗi loại; 0,25 μl Taq polymerase 5 units.

- Chu trình nhiệt:

Phản ứng PCR đƣợc thực hiện theo chế độ: 95C/4 phút; 40 chu kỳ (95C/1 phút; 53C/1 phút; 72C/1 phút 30 giây); 72C/10 phút, 25°C/1 giờ.

Sản phẩm PCR đƣợc điện di trên gel 0,8% agarose và sau đó đƣợc tinh sạch. * Phương pháp tách dòng gen mã hóa riboxom 16 S

- Tạo vector tái tổ hợp (gắn dính sản phẩm PCR vào pJET1.2):

Phản ứng gắn dính sản phẩm PCR vào vector tách dòng pJET1.2 đƣợc thực hiện theo chỉ dẫn của (Fermentas). Hỗn hợp gồm 5 µl đệm 2x; 1,5 µl sản phẩm

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

PCR; 0,5 µl enzyme blunting; 2,5 µl H2O và hỗn hợp đƣợc ủ ở 70°C trong 15 phút. Bổ sung 0,5 µl pJET1.2 và 0,5 µl T4 DNA ligase rồi ủ qua đêm ở nhiệt độ 22°C tạo plasmid tái tổ hợp.

- Chuẩn bị tế bào khả biến: Nhặt một khuẩn lạc E. coli nuôi lắc ở 37°C trong 3 ml môi trƣờng LB qua đêm. Lấy 50 ml môi trƣờng LB có bổ sung 1% dịch nuôi cấy qua đêm trong 3 ml và nuôi ở 37°C lắc 200 rpm trong 2,5-3 giờ khi OD đạt 0,6-0,8. Khi đạt OD để dịch nuôi cấy trong đá 30 phút sau đó li tâm 4000 rpm trong 15 phút ở 4°C. Rửa 2 lần, mỗi lần 25 ml H2O lạnh đã khử trùng. Lấy 3 ml 10% glycerol hòa tan tế bào và li tâm 4000 rpm trong 15 phút ở 4°C. Sau đó cho 200 µl 10% glycerol vào và chia vào mỗi ống eppendoff 1,5 ml đã khử trùng 50 µl tế bào khả biến. Tế bào có thể đƣợc dùng để biến nạp ngay hoặc bảo quản ở -84C cho các lần biến nạp sau.

- Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E. coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt.

Một khuẩn lạc E. coli đƣợc cấy chuyển vào 3 ml môi trƣờng LB, lắc 200 vòng/phút ở 37°C qua đêm. Một trăm ml môi trƣờng LB đƣợc tiếp giống với 1 ml dịch tế bào qua đêm, nuôi lắc ở 37°C với 200 vòng/phút. Khi OD600nm đạt 0,4-0,6 (khoảng 2-3 giờ nuôi cấy), dịch nuôi cấy đƣợc đặt vào đá lạnh 1 giờ, rồi ly tâm 10 phút ở 4°C với 6000 vòng/phút. Tủa tế bào đƣợc hòa đều trong 100 ml dung dịch 100 mM CaCl2 lạnh và vô trùng, ủ đá 15 phút và ly tâm nhƣ trên. Tủa tế bào lại đƣợc hòa đều trong 40 ml (100 mM CaCl2) lạnh vô trùng, ủ đá khoảng 1 giờ và ly tâm 10 phút với 4000 vòng/phút. Tủa tế bào lại đƣợc hòa vào 500 μl dung dịch 100 mM CaCl2 lạnh, vô trùng chứa 15% glycerol. Dịch hỗn hợp tế bào và glycerol đƣợc chia nhỏ vào các ống eppendorf, dùng để biến nạp ngay hoặc bảo quản ở -84°C.

5 μl plasmid tái tổ hợp đƣợc trộn với 40 μl dịch tế bào làm khả biến, ủ 20-30 phút ở 4°C. Hỗn hợp đƣợc sốc nhiệt 45 giây ở 42°C. Sau đó đặt ngay vào đá lạnh 5 phút rồi bổ sung 250 μl môi trƣờng LB đã khử trùng. Sau khi nuôi lắc hỗn hợp khoảng 60 phút ở 37°C với 200 vòng/phút, 50-200 μl dịch tế bào đã biến nạp đƣợc cấy trải trên môi trƣờng LB đặc chứa kháng sinh ampicillin ủ qua đêm ở 37°C.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

- Tách chiết DNA plasmid tái tổ hợp

Một khuẩn lạc đã đƣợc biến nạp trên đĩa thạch đƣợc cấy vào 3 ml môi trƣờng LB chứa ampicillin, nuôi lắc qua đêm ở 37°C, 200 vòng/phút. Dịch tủa tế bào thu đƣợc sau khi ly tâm 5 phút với 6000 vòng/phút đƣợc lắc rung 30 giây trong 150 µl Sol I thành dịch đồng nhất, ủ 15-20 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó 150 µl Sol II đƣợc bổ sung vào hỗn hợp và đảo nhẹ, tiếp tục bổ sung 150 µl Sol III vào hỗn hợp đảo nhẹ. Hỗn hợp đƣợc bổ sung 450 µl chloroform/isoamyl alcohol 24:1, lắc nhẹ và ly tâm 10 phút với 12500 vòng/phút trong. 450 µl pha trên đƣợc hút sang ống mới, bổ sung 320 µl isopropanol, lắc nhẹ và ủ 5 phút ở -80°C để tủa DNA plasmid. Tủa DNA plasmid sau khi ly tâm 12500 vòng/phút trong 5 phút đƣợc rửa với 500 µl 70% ethanol ở 4°C để loại muối và isopropanol, làm khô trong không khí ở nhiệt độ phòng. Tủa plasmid đƣợc hòa trong đệm TE pH 8,0 hoặc nƣớc khử ion vô trùng và điện di kiểm tra sản phẩm tách plasmid rồi bảo quản ở -20°C.

- Cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng enzyme giới hạn (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

DNA plasmid tái tổ hợp đƣợc cắt kiểm tra bằng enzyme giới hạn XhoI và XbaI qua đêm ở 37C để kiểm tra phân đoạn chèn. Vì vectơ tách dòng đƣợc thiết kế điểm cắt của XbaI và XhoI tại hai đầu gắn DNA ngoại lai, vì vậy để kiểm tra chắc chắn dòng đƣợc chọn có mang sản phẩm mong muốn hay không, plasmid tái tổ hợp sau khi tách chiết đƣợc cắt bằng hai enzyme XbaI và XhoI.

+ Thành phần phản ứng cắt: Hỗn hợp phản ứng gồm 3,5 µl DNA plasmid tái tổ hợp; 0,25 µl enzyme giới hạn mỗi loại; 2 µl đệm Tango Y+ và bổ sung H2O cất tiêm đến 10 µl.

+ Sau phản ứng, sản phẩm cắt đƣợc điện di trên gel 0,8% agarose để kiểm tra. - Phương pháp điện di trên gel agarose

Nguyên lí của phƣơng pháp này là dựa vào đặc tính của DNA là đại phân tử tích điện âm, dó đó trong môi trƣờng có điện trƣờng, các phân tử DNA có kích thƣớc khác nhau di chuyển với tốc độ khác nhau từ cực âm sang cực dƣơng. Gel agarose làm giá đỡ để phân tách các phân tử DNA trong điện trƣờng.

Điện di DNA hoặc plasmid trên gel 0,8% agarose. Agarose đƣợc pha trong đệm 1x TBE và đun tan hoàn toàn. Sau đó để nguội xuống khoảng 60C và đổ vào

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

khay điện di đã cài lƣợc sẵn. Khi gel đã đông ổn định khoảng 30 phút thì gỡ lƣợc ra, đặt vào buồng điện di và tra mẫu. Gel đƣợc nhuộm trong EtBr khoảng 5 phút, EtBr có thể cài xen vào trong DNA và phát sáng dƣới ánh sáng tia cực tím, do đó có thể phát hiện ra sự hiện diện của DNA.