3. Nội dung nghiên cứu
2.3.5.Xác định gen VT1, VT2 của các chủng E.coli bằng phản ứng PCR
Phƣơng pháp PCR dùng để xác định một số yếu tố độc lực cơ bản của vi khuẩn đƣợc thực hiện với một số cải tiến về phƣơng pháp và thực hiện quy trình phản ứng. Có thể tóm tắt nhƣ sau:
- AND đích: : Là một lƣợng nhỏ khuẩn lạc của chủng cần xác định mọc trên đĩa thạch máu ở 37oC từ 18 – 24 giờ.
- Chủng vi khuẩn E. coli chuẩn quốc tế, dùng làm đối chứng dƣơng (đã đƣợc kiểm định chắc chắn có mang gen quy định các yếu tố độc lực), hoặc đối chứng âm (không mang gen quy định các yếu tố độc lực).
- Các cặp mồi phản ứng PCR: Do hãng Life Technologies (Gibco, BRL) sản xuất và đƣợc bảo quản ở nhiệt độ -20oC. Trình tự, nucleotide của các cặp mồi.
Gen
đích Primers Chuỗi Primers (5’-3’)
Kích thƣớc sản phẩm (bp) VT1 VT1-F 5’ – CAG TTA ATG TGG TGG CGA AG – 3’ 894
VT1-R 5’ – CTG CTA ATA GTT CTG CGC ATG – 3’
VT2 VT2-F 5’ – CTT CGG TAT CCT ATT CCC GG – 3’ 481 VT2-R 5’ – GGA TGC ATC TCT GGT CAT TG – 3’
- Phản ứng PCR: + Thành phần phản ứng PCR: STT Thành phần Thể tích (µl) 1 AMP buffer 5 2 Mồi xuôi 1 3 Mồi ngƣợc 1
4 Taq DNA polymerase (10mM) 0,05
5 DNA khuôn của chủng vi khuẩn cần kiểm tra. 2,0
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Tổng thể tích 25
+ Tiến hành trên máy nhân gen (Mastercycler, Eppendort) + Chƣơng trình chạy PCR:
Các giai đoạn phản ứng Nhiệt độ (oC) Thời gian (phút) Số chu kỳ Tiền biến tính 94 5 1 Biến tính Bắt cặp Tổng hợp 94 50 72 1 1 1 30 Kéo dài 72 7 1 Ổn định mẫu 4 ∞
- Kiểm tra sản phẩm PCR: Sản phẩm PCR đƣợc tiến hành chạy điện di trên thạch agarose 2% (Bibco, BRL) trong dung dịch 1xTAE với hiệu điện thế 100 Vôn trong 30 phút. Nhuộm trong đệm TAE có bổ sung Ethidium bromide trong 15 phút. Sản phẩm PCR đƣợc quan sát dƣới đèn UV (300 nm) và ảnh đƣợc chụp bằng hệ thống Gel Doc 2000 (Bio - Rad) [16].
2.3.6. Nghiên cứu đặc điểm di truyền bằng nhân dòng đọc trình tự đoạn gen mã hóa riboxom 16S từ E. coli