- Hoà tan trong HCl 4 ml KI 20%, 16 ml HCl
3.3.4 p– Nitrophenol
Hoá chất trừ sâu lân hữu cơ là nguyên nhân phổ biến gây ra các vụ nhiễm độc cấp ở n−ớc ta. Trong khi đó, việc chẩn đoán chủ yếu dựa vào triệu chứng lâm sàng và xét nghiệm gián tiếp thông qua xác định hoạt tính enzym cholinesterase. Việc xác định trực tiếp chất độc trong máu, hoặc n−ớc tiểu bệnh nhân gặp nhiều khó khăn. Trong máu, hợp chất lân hữu cơ nhanh chóng bị phân huỷ nên có thể xác định các sản phẩm chuyển hoá p-nitrophenol của chúng trong n−ớc tiểu.
Sự có mặt của p-nitrophenol trong n−ớc tiểu cho phép khẳng định nhiễm độc parathion hoặc methylparathion. Đây là hoạt chất của nhiều loại thuốc trừ sâu l−u thông trên thị tr−ờng n−ớc ta nh− wofatox, ofatox... Ngoài ra, p-nitrophenol là một trong ba mononitrophenol có độc tính cao nhất và đ−ợc sử dụng rất nhiều trong công nghiệp, nh− trong sản xuất hoá chất bảo vệ thực vật, d−ợc phẩm, nhuộm, cao su, gỗ... và là một trong những khí thải giao thông gây ô nhiễm môi tr−ờng.
Chúng tôi tiến hành nghiên cứu này nhằm xác định hàm l−ợng p- nitrophenol bằng sắc ký lỏng cao áp (HPLC) để có thể phát hiện đ−ợc sản phẩm này trong n−ớc tiểu ở các hàm l−ợng nhỏ (10-6 g) phục vụ chẩn đoán và đánh giá mức độ nhiễm độc.
+. Khảo sát độ lặp lại, độ chính xác của ph−ơng pháp:
Bơm mỗi lần 20àl dung dịch 10 ppm vào hệ thống sắc ký, lặp lại 5 lần, theo dõi thời gian l−u và diện tích pic.
Bảng 3.44: Kết quả khảo sát độ lặp lại và độ chính xác.
STT tR ( phút) Số đo diện tích pic
1 2,33 4,6469 2 2,29 4,6874 2 2,29 4,6874 3 2,30 4,7464 4 2,29 4,7678 5 2,31 4,7560 Trung bình 2,30±0,02 4,7569±0,081
Không phát hiện chất lạ cùng thời gian l−u với p-nitrophenol, thời gian l−u của chất phân tích là 2,3 phút. Kỹ thuật có độ lặp lại và độ chính xác cao.
+. Khảo sát khoảng tuyến tính, xây dựng đ−ờng chuẩn định l−ợng
- Khảo sát khoảng tuyến tính
Bảng 3.45: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính
STT Nồng độ Số đo diện tích pic
1 0,1 0,8574 2 1 1,1876 3 5 2,7640 4 10 4,7596 5 20 8,7507 6 30 12,9418 7 50 20,7248
Để khảo sát khoảng tuyến tính của quá trình, chúng tôi sử dụng các mẫu có nồng độ khác nhau để theo số đo diện tích pic và xử lý kết quả. Dung dịch đo trong khoảng nồng độ dự tính của mẫu lần l−ợt nh− bảng trên:
Từ kết quả trên ta thấy khoảng tuyến tính của để định l−ợng p-nitrophenol nằm trong khoảng 0,1-50ppm.
- Xây dựng đ−ờng chuẩn định l−ợng
Đ−ờng chuẩn định l−ợng đ−ợc xây dựng theo ph−ơng pháp ngoại chuẩn trên cơ sở các dung dịch có nồng độ nằm trong khoảng tuyến tính của ph−ơng pháp. Ph−ơng trình tuyến tính có dạng y = 4,0626x + 5,7813 R2 = 0,9987 0 50 100 150 200 250 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 nồng độ p-nitrophenol diện tích pic
Đồ thị 3.4: Đ−ờng chuẩn và ph−ơng trình tuyến tính của p-nitrophenol
+Khảo sát giới hạn phát hiện.
Giới hạn phát hiện định l−ợng p-nitrophenol chính bằng 3 lần tỷ số giữa độ lệch tín hiệu nền với độ nhạy phát hiện tín hiệu của chất. Qua khảo sát chúng tôi thấy bằng ph−ơng pháp này cho phép phát hiện p-nitrophenol ở nồng độ 0,005ppm khi bơm vào hệ thống HPLC 20àl dung dịch (t−ơng ứng 10-1ng).
+. Khảo sát hiệu suất thu hồi và sai số của quy trình trên nền mẫu thật.
Mẫu thu hồi đ−ợc tiến hành bằng cách thêm các l−ợng mẫu chuẩn xác định khác nhau vào nều mẫu thực đã đ−ợc xác định không có p-nitrophenol, rồi tiến hành phân tích nh− quy trình. Hiệu suất thu hồi đ−ợc chỉ ra trong bảng sau
Bảng 3.46:Hiệu suất thu hồi của p-nitrophenol trong nền mẫu thực
S TT TT Nồng độ thêm vào mẫu (ppm) Nồng độ xác định (ppm)
Hiệu suất thu hồi (%)
1 0,1 0,09 90,00
2 5 4,87 97,40
3 20 19,61 98,05
4 40 39,85 99,63
Hiệu suất thu hồi trung bình ± SD 96,27+4,94 Sai số trung bình(%) 4,45
Qua quá trình khảo sát chúng tôi thấy, quy trình này có độ chính xác cao, phù hợp áp dụng để phân tích thực tế
Từ các kết quả khăo sát trên, chúng tôi thấy quy trình phân tích trên có hiệu suất thu hồi, độ lặp lại và độ chính xác nằm trong giới hạn cho phép có thể áp dụng vào thực thế để xét nghiệm p-nitrophenol trong mẫu n−ớc tiểu.
+. Quy trình phân tích p-nitrophenol trong mẫu n−ớc tiểu
+. Lấy mẫu:
Lấy 100 ml n−ớc tiểu không sử dụng chất bảo quản, tiến hành ly tâm 4000vòng/phút trong 5 phút loại bỏ cắn.
Mẫu đ−ợc phân tích ngay hoặc bảo quản 2ữ80C cho đến khi phân tích.
Xử lý mẫu:
N−ớc tiểu đ−ợc khử tạp chất sơ bộ bằng dung dịch bariclorua10%, axit clohydric (1:1), axit photphotungstic 10%. Lọc lấy dịch trong.
5.3.2 Chiết mẫu
Dịch lọc đ−ợc chiết bằng ete etylic 3 lần, mỗi lần 15ml. L−ợng ete đ−ợc tập trung lại và cô bằng khí nitơ để thu đ−ợc 0,15ml dịch mẫu.
Hình 3.9: Sơ đồ quy trình xác định hàm l−ợng p-nitrophenol trong mẫu n−ớc tiểu bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao
- Tiến hành phân tích
Tiến hành bơm mẫu chuẩn và mẫu phân tích vào hệ thống sắc ký lỏng cao áp. Thời gian l−u của p-nitrophenol là 2,3phút.
Điều kiện làm việc của HPLC:
- Cột sắc ký: SUPELCO LC-18DB; 150 ì 4,6 mm. - Detector : UV/VIS ế 2ml BaCl2 10% ế1ml HCl 1/1 ế1ml axit photphotungstic 10% N−ớc tiểu 50ml Lọc lấy dịch trong Chiết bằng ete etylic (3lần ì15ml) Cô bằng khí N2 còn 0,15ml HPLC
- B−ớc sóng: 254nm. - Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút.
- Pha động: metanol: n−ớc( 60:40). - Thể tích vòng bơm: 20àl
Hình3.10: Sắc ký đồ của p-nitrophenol trên HPLC
-Tính kết quả
Hàm l−ợng p-nitrophenol đ−ợc tính theo công thức sau
V V V C ppm C( )= xì 2 Trong đó:
Cx: là hàm l−ợng mẫu đ−ợc tính theo ph−ơng trình hồi quy tuyến tính V1: Thể tích mẫu đem phân tích (ml)
V2: thể tích mẫu cuối (ml).
+. Khảo sát một số mẫu thực tế
Th−ờng quy kỹ thuật này đã đ−ợc sử dụng để xác định hàm l−ợng p- nitrophenol trong các mẫu n−ớc tiểu thỏ bị gây độc thực nghiệm bằng p- nitrophenol qua đ−ờng tiêu hoá với liều liều 50mg/kg thể trọng. Kết quả theo dõi l−ợng n−ớc tiểu thu đ−ợc và hàm l−ợng p-nitrophenol đ−ợc trình bày ở bảng sau:
Bảng 3.47: L−ợng n−ớc tiểu thu đ−ợc và hàm l−ợng p-nitrophenol trên thỏ bị nhiễm độc thực nghiệm
Hàm l−ợng (10-2ppm) Thời điểm L−ợng n−ớc tiểu
thu đ−ợc (ml) X SD Tr−ớc nhiễm độc 615 ± 31 0,65 0,04 6h 73 ± 6 1,87 0,11 24h 542 ± 27 2,84 0,13 48h 620 ± 29 25,41 1,87 72h 638 ± 36 30,90 2,76 96h 631 ± 31 25,61 2,38 120h 480 ± 25 9,74 0,83 Sau nhiễm độc ( n=12) 144h 477 ± 28 1,22 1,11