- Hoà tan trong HCl 4 ml KI 20%, 16 ml HCl
3.3.5 Xác định hoạt tính Cholinesterase (ChE) huyết thanh
ở trong máu có 2 loại enzym có tác dụng thuỷ phân các este của cholin đặc biệt là acetylcholin. Một loại chủ yếu trong hồng cầu và tổ chức thần kinh gọi là cholinesterase thật (dùng để chỉ enzym đặc tr−ng ở hồng cầu). Một loại có nhiều trong tổ chức và huyết thanh gọi là cholinesterase giả. Trong lâm sàng th−ờng chỉ định hoạt độ enzym cholinesterase giả khi nhiễm độc chất độc lân hữu cơ cũng nh− các chất độc cacbamat.
Đối với các chất độc lân hữu cơ dùng trong nông nghiệm với các tác dụng diệt côn trùng hoặc các chất độc quân sự và các chất bảo vệ thực vật cacbamat đều làm giảm hoạt độ enzym cholinesterase bằng cách ức chế enzym này. Theo Aldridge, enzym này có thể hạ xuống 40% so với mức bình th−ờng, tr−ớc khi các triệu chứng lâm sàng về nhiễm độc xuất hiện. Với những tr−ờng hợp nặng enzym có thể giảm rất nhiều hoặc không còn hoạt động ở huyết thanh. Vì vậy, ng−ời ta th−ờng xác định hoạt tính của enzym này để kiểm tra và đề phòng nhiễm độc.
+. Lựa chọn ph−ơng pháp.
Hiện nay, có rất nhiều quy trình xác định hoạt độc cholinesterase. Ph−ơng pháp kinh điển là đo số l−ợng acid acetic tạo thành nh− một th−ớc đo cho hoạt
tính enzym ChE. Các ph−ơng pháp xác định hoạt tính cholinesterase đ−ợc sử dụng trong các cơ sở y tế nh− ph−ơng pháp của Hestrin và De la Huerga, ph−ơng pháp của Molander và Korobkin …phổ biến hiện nay là ph−ơng pháp Ellman.
Để triển khai kỹ thuật này để xét nghiệm thuận lợi, ổn định và áp dụng vào xét nghiệm thực tế, chúng tôi đã lựa chọn quy trình xét nghiệm hoạt độ cholinesterase trong huyết thanh theo tiêu chuẩn của “Standard Method 94” - Mỹ, và nghiên cứu triển khai kỹ thuật này tại Trung tâm Phòng chống nhiễm độc - Học viện Quân y
Nguyên tắc của ph−ơng pháp là cholinesterase (CHE) xúc tác cho quá trình thuỷ phân của cơ chất butyrylthiocholin thành butyrat và thiocholin. Thiocholin khử hexacyanoferrat (III) thành hexacyanoferrat (II). Hoạt độ của CHE trong mẫu đ−ợc xác định bằng quang phổ kế tại b−ớc sóng 405nm.
Quy Trình xác định hoạt tính cholinesterase huyết thanh
+ Chuẩn bị hoá chất
- Thuốc thử 1:
Pha 9,2mmol natri pyrophosphat (PA) và 0,25mmol kali hexacyano- ferrate(III) (PA) trong 100ml n−ớc cất tinh khiết lần bằng bình định mức 100ml. Bảo quản ở nhiệt độ 2-80C trong chai nâu, nút kín, tránh ánh sáng.
- Thuốc thử 2:
Pha 9,1mol butyrylthiocholin trong 100ml n−ớc cất tinh khiết. Bảo quản lạnh ở 2ữ80C, tránh ánh sáng, đóng lại ngay sau khi sử dụng. Thời hạn sử dụng thuốc thử 2: 90 ngày sau khi pha.
+. Điều kiện Đo quang
Độ hấp thụ của dung dịch đ−ợc xác định sử dụng quang phổ kế ở b−ớc sóng 405nm. Dùng n−ớc trong cuvet so sánh.
+. Chuẩn bị mẫu
Sử dụng huyết thanh, huyết t−ơng, không đ−ợc haemolized (heparin, EDTA) và nhanh chóng ly tâm khỏi hồng cầu.
+. Tiến hành phân tích
Giữ các hoá chất và mẫu ở nhiệt độ phòng tr−ớc khi thực nghiệm Cơ chất nền
Nhỏ vào các ống xét nghiệm Mẫu trắng Mẫu
Thuốc thử 1 1000àl 1000àl
N−ớc cất 20àl -
Mẫu - 20àl
Trộn, ủ khoảng 5 phút tại 370C và thêm:
Thuốc thử 2 200àl 200àl
Trộn và đọc độ hấp thụ của mẫu trắng và mẫu sau 90s.
Bắt đầu và dừng đồng hồ đọc chính xác sau chính xác 30, 60, 90s.
∆A/30sec. = [∆A/30sec. Mẫu ] – [∆A/30sec.mẫu trắng] Mẫu nền
NHỏ vào các ống xét nghiệm
Thuốc thử làm việc 1000àl
Mẫu 10àl
Trộn, ủ trong 2 phút tại 370C và đọc độ hấp thụ. đọc độ hấp thụ lại chính xác sau 30, 60 và 90 giây. xác định ∆A/30sec.
+.Tính kết quả
Hoạt độ Cholinesterase (U/l) = 131600 ì∆A/30sec.
Khoảng xác định hoạt độ cholinesterase < 25.000U/l (∆A/30sec t−ơng ứng với tối đa 0,19). Nếu mẫu có hoạt độ cholinesterase lớn hơn 25.000 U/l thì tiến hành pha loãng mẫu.
+. áp dụng thực tế
Quy trình xác định hoạt độ cholinesterase trong huyết thanh này đã đ−ợc ứng dụng tại Trung tâm Phòng chống nhiễm độc học viện quân y để xét nghiệm nhiều mẫu trên bệnh nhân nhiễm độc HCBVTV.
+. Kết luận
Qua quá trình nghiên cứu, chúng tôi đã lựa chọn, hoàn thiện và triển khai đ−ợc quy trình xác định hoạt độ cholinesterase trong huyết thanh. Ph−ơng pháp đơn giản, thuận tiện, ổn định và đã đ−ợc áp dụng vào công tác xét nghiệm độc chất trong dịch sinh học tại Trung tâm Phòng chống nhiễm độc - Học viện Quân y.
Đã áp dụng quy trình vào thực tế xét nghiệm nhiều mẫu huyết thanh của các bệnh nhân bị nhiễm độc, tự tử bằng HCBVTV, đ−a ra những kết luận chính xác phục vụ cho công tác điều trị bệnh nhân một cách có hiệu quả hơn.
Ch−ơng IV Bàn luận