Th−ờng quy kỹ thuật này áp dụng định l−ợng CN-trong mẫu n−ớc tiểu thông qua việc định l−ợng hàm l−ợng thiocyanat.
Thiocyanat trong mẫu phân tích đ−ợc oxy hoá bằng kali permanganat trong môi tr−ờng acid ở nhiệt độ thích hợp, giải phóng ra acid cyanhydric. Acid cyanhydric tạo thành phản ứng với picrat tạo ra một dung dịch có màu và đ−ợc xác định bằng quang phổ kế tại b−ớc sóng 510nm. Cơ chế của phản ứng nh− sau: 6MnO4- + 5SCN- + 13H+ = 6 Mn2+ + 5 HCN + 5 SO42- + 4 H2O
3HCN + picrat izopurpurin + HCNO (dung dịch có màu)
+. Pha dung dịch chuẩn.
Kali thiocyanat đ−ợc sấy đến khối l−ợng không đổi ở 60oC.
Dung dịch gốc thiocyanat (10%): Cân chính xác 1g SCN- vào bình định mức 10ml, thêm n−ớc cất hai lần đến vạch mức.
Dung dịch chuẩn thực nghiệm: đ−ợc pha từ dung dịch gốc thành các dung dịch có nồng độ 1000ppm, 100ppm.
Các dung dịch gốc và chuẩn thực nghiệm đ−ợc đựng trong chai thuỷ tinh nâu nút màivà bảo quản trong tủ lạnh.
Chuẩn bị giấy tẩm picrat:
Ngâm giấy lọc vào dung dịch axit picric bão hoà trong n−ớc trong 30 phút, sau đó lấy ra phơi, để khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng. Ngâm tiếp giấy trên vào dung dịch natri cacbonat 10% trong 30 phút, sau đó lấy ra, ép vào giữa hai tờ giấy lọc khác, để khô tự nhiên nh− trên. khi khô, cắt nhỏ giấy lọc thành các mảnh có kích th−ớc 1,5ì1,5 cm.
+. Xây dựng quy trình xác định cyanua trong mẫu n−ớc tiểu
- Khảo sát tác nhân oxy hoá thiocyanat
Dung dịch thioxyanat đ−ợc phản ứng với KMnO4, K2Cr2O7và Ce(SO4)2 trong môi tr−ờng H2SO4 trong lọ kín có chứa giấy tẩm picrat. Sau khi ổn nhiệt 300C trong 6giờ, giấy đ−ợc rửa giải trong 3,5ml n−ớc cất trong 20 phút và đ−ợc
- Khảo sát nồng độ và thể tích các tác nhân oxy hoá thiocyanat
Để lựa chọn điều kiện phản ứng oxy hoá thiocyanat trong môi tr−ờng n−ớc tiểu chúng tôi đã khảo sát sát nồng độ dung dịch KMnO4 với các nồng độ sau: 1ữ
2M và thể tích của dung dịch từ 0,5-2 ml và H2SO4 với các nồng độ sau: từ 1ữ2M và thể tích của dung dịch từ 0,5-2ml ở nhiệt độ 30oC trong 8h. Theo dõi độ hấp thụ của từng loại dung dịch.
- Khảo sát nhiệt độ và thời gian tiến hành phản ứng.
Tiến hành khảo sát thời gian phản ứng từ 3ữ 6giờ và nhiệt độ phản ứng từ 30 ữ
600C. Theo dõi độ hấp thụ của từng loại dung dịch.
+. Khảo sát khoảng tuyến tính, xây dựng đ−ờng chuẩn ngoại suy định l−ợng cyanua và xác định độ chính xác của ph−ơng pháp.
- Khảo sát khoảng tuyến tính của ph−ơng pháp.
Khoảng tuyến tính đ−ợc khảo sát với các dung dịch có độ pha loãng khác nhau từ dung dịch gốc, theo dõi độ hấp thụ của các dung dịch.
- Xây dựng đ−ờng chuẩn.
Dựa vào kết quả nghiên cứu thực nghiệm xác định khoảng tuyến tính của ph−ơng pháp ở trên, đ−ờng chuẩn đ−ợc xây dựng với các dung dịch có nồng độ nằm trong khoảng tuyến tính.
- Xác định độ chính xác của ph−ơng pháp.
Xác định độ chính xác của ph−ơng pháp đ−ợc tiến hành bằng cách định l−ợng các dung dịch có các l−ợng thiocyanat chính xác đ−ợc thêm vào.
+. Cách tính kết quả định l−ợng.
Hàm l−ợng cyanua đ−ợc tính theo công thức sau
1 2 2 ) ( V V C K ppm C = ì xì Trong đó:
Cx: là hàm l−ợng thiocyanat có trong mẫu đ−ợc tính theo ph−ơng trình hồi quy tuyến tính
K: là hệ số chuyển đổi từ hàm l−ợng thiocyanat sang hàm l−ợng cyanua theo ph−ơng trình phản ứng (K= 0,45).
V1: Thể tích mẫu đem phân tích (ml) V2: thể tích mẫu cuối (ml).
+. áp dụng qui trình tiến hành phân tích xác định cyanua trong một số mẫu thực tế.
Sau khi xây dựng đ−ợc qui trình phân tích cyanua trong mẫu n−ớc chúng tôi áp dụng qui trình này vào phân tích các mẫu n−ớc tiểu của động vật nghiên cứu thực nghiệm
Thỏ không phân biệt giống, có trọng l−ợng 1,8 - 2,2kg đ−ợc tiêm một liều 1mg KCN/kg khối l−ợng duy nhất vào tĩnh mạch tai thỏ. Khi thỏ xuất hiện triệu chứng, nhanh chóng cấp cứu bằng Na2S2O3 10%, kết hợp hô hấp nhân tạo cho đến khi thỏ trở về trạng thái bình th−ờng. Nuôi thỏ trong chuồng có hệ thống hứng n−ớc tiểu để lấy mẫu. N−ớc tiểu thỏ đ−ợc phân tích tại các thời điểm 0; 1; 5; 10; 24; 30; 40; 48 và 60 giờ sau nhiễm độc
2.3.2 Asen
Phân tích asen bằng ph−ơng pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử
+. Pha dung dịch chuẩn
- Dung dịch chuẩn gốc.
Dung dịch chuẩn gốc của As (III) (1000 ppm):
Cân chính xác 1,3200 g As2O3 đã sấy khô ở nhiệt độ 110 0C trong thời gian 1 h vào cốc có dung tích 250 ml, thêm 50 ml HCl (d=1,19), khuấy cho tan hết. Chuyển toàn bộ dung dịch vào bình định mức có dung tích 1000 ml, định mức bằng dung dịch HCl 3N, lắc đều. Bảo quản trong điều kiện mát.
Dung dịch chuẩn gốc của As (V) (1000 ppm):
Cân chính xác 1,5339 g As2O5 đã sấy khô ở nhiệt độ 110 0C trong thời gian 1 h vào cốc có dung tích 250 ml, thêm 50 ml HCl (d=1,19), khuấy cho tan
hết. Chuyển toàn bộ dung dịch vào bình định mức có dung tích 1000 ml, định mức bằng dung dịch HCl 3N, lắc đều. Bảo quản trong điều kiện mát.
- Dung dịch làm việc:
Để có dung dịch As (III) và As (V) có các nồng độ nhỏ hơn, bằng cách pha loãng các dung dịch chuẩn gốc t−ơng ứng với dung dịch HCl 4N. Các dung dịch này th−ờng dùng ngay khi pha, bảo quản trong điều kiện mát.
- Các loại dung dịch khác.
Dung dịch KI 20 % (g/ml):
Cân 50 g KI vào cốc có dung tích 250 ml, cho vào cốc 100 ml n−ớc cất, khuấy cho tan hết. Cho dung dịch vào bình định mức 250 màu nâu, dùng n−ớc cất tráng sạch cốc, rồi định mức tới vạch. Bảo quản dung dịch chỗ tối, trong điều kiện mát. Dung dịch có thể dùng trong 1 tuần.
Dung dịch NaBH4:
Đây là dung dịch không bền nên chỉ pha khi dùng theo các nồng độ cần thiết.
Dung dịch LaCl3 3,8%:
Cân 25 g La2O3 vào cốc thủy tinh 500 ml, rót từ từ dung dịch HCl (1:1) vào, khuấy cho tan hết, để nguội, chuyển toàn bộ dung dịch sang bình định mức 500 ml, dùng dung dịch HCl trên để định mức tới vạch.
Dung dịch tartric 10%:
Cân 10 g tinh thể axit tartric vào cốc 100 ml, thêm n−ớc cất hòa tan, rồi đun nhẹ cho tan hết, để nguội rồi chuyển vào bình định mức dung tích 100 ml.
+. Tối −u hóa điều kiện phân tích.
Qua h−ớng dẫn của nhà sản xuất đối và tham khảo các tài liệu chúng tôi rút ra một số điều kiện khi tiến hành phân tích As đối với máy quang phổ hấp thụ nguyên tử loại AA 6501S nh− sau:
- B−ớc sóng dùng để đo là 197,3 nm. - Độ rộng của khe sáng là 0,5 nm. - Chiều cao đèn nguyên tử hóa là 10 nm.
- C−ờng độ dòng đèn catot rỗng là 10 mA.
- L−u l−ợng khí C2H2 và không khí là 1,2 l/ph và 6,2 l/ph t−ơng ứng.
Ngoài một số thông số này, còn một số thông số rất quan trọng cho quá trình phân tích As trên máy quang phổ hấp thụ nguyên tử mà các nhà sản xuất cũng nh− qua các tài liệu chúng tôi nhận thấy có sự sai khác đáng kể. Xuất phát từ vấn đề đó chúng tôi đã tiến hành chọn các thông số này qua nghiên cứu thực nghiệm.
- Khảo sát nồng độ các chất tham gia tại buồng phản ứng.
Chuẩn bị các dung dịch của NaBH4 và HCl cho phản ứng tạo asin, điều chỉnh tốc độ dẫn các dung dịch này và mẫu vào buồng phản ứng bằng cách chỉnh tốc độ của bơm nhu động.
- Khảo sát nồng độ của NaBH4 và HCl.
Để khảo sát sự ảnh h−ởng của nồng độ NaBH4 ta cố định nồng độ của dung dịch HCl là 4 N và khảo sát sự thay đổi của nồng độ NaBH4 ảnh h−ởng đến độ hấp thụ nguyên tử với các nồng độ khác nhau từ 0,1-1,0 %.
Khi khảo sát sự ảnh h−ởng của nồng độ HCl ta cố định nồng độ của NaBH4 theo kết quả vừa khảo sát, nồng độ HCl đ−ợc khảo sát từ 0,5-8,0 N.
- Khảo sát điều kiện khử.
Nồng độ KI cho phản ứng khử:
Chúng tôi tiến hành khảo sát nồng độ KI từ 0,4-3,2% trong thời gian 40 phút trên bếp cách thủy.
Thời gian cho phản ứng khử:
Tiến hành khảo sát trong khoảng thời gian từ 10-60 phút, phản ứng khử đ−ợc đun trên bếp cách thủy.
- Tách và làm giàu As bằng cộng kết với La(OH)3.
Khảo sát sự ảnh h−ởng của một số nguyên tố có trong mẫu lên hiệu suất thu hồi của ph−ơng pháp khi dùng La(OH)3 làm tác nhân cộng kết. Các nguyên tố chọn nghiên cứu là Cu, Ni, Co, và Zn có hàm l−ợng khoảng 50 mg cho mỗi nguyên tố.
Dùng 4 ml dung dịch LaCl3 3,8% thêm vào 200 ml dung dịch có chứa các nguyên tố trên trong môi tr−ờng NH4OH có pH ~ 9, trong điều kiện này As kết tủa cùng La(OH)3. Lọc, rửa và hòa tan hoàn toàn kết tủa bằng axit HCl 4N, dung dịch thu đ−ợc đem đun trên bếp cách thủy trong 20 phút, để nguội và đo hấp thụ.
- Xây dựng đ−ờng chuẩn.
Đ−ờng chuẩn ngoại suy của ph−ơng pháp phân tích định l−ợng As đ−ợc xây dựng đối với các dung dịch chuẩn có các nồng độ 2; 5; 10 và 20 ppb.
- Đánh giá sai số và giới hạn phát hiện của ph−ơng pháp. Xác định giới hạn phát hiện của ph−ơng pháp.
Dùng dung dịch 0,5 ppb để xác định giới hạn phát hiện của ph−ơng pháp so với mẫu trắng.
Giới hạn phát hiện As đ−ợc tính theo công thức: Cmin x 3An
Giới hạn xác định = Av
Trong đó:
- Cmin là nồng độ nhỏ nhất của đ−ờng chuẩn - An là độ hấp thụ nền
- Av là độ hấp thụ của nồng độ Cmin
Đánh giá sai số của ph−ơng pháp.
Chúng tôi chọn 05 cấp nồng độ khác nhau nằm trong khoảng tuyến tính của đ−ờng chuẩn, mỗi cấp nồng độ lặp lại 05 lần. các kết quả thí nghiệm đ−ợc xử lí theo ph−ơng pháp thống kê.
- Cách tính kết quả.
Hàm l−ợng As trong mẫu cơm hoặc chất nôn đ−ợc tính theo công thức sau: Am Cc
X = --- x --- x V0 Ac m
Trong đó: - X: Hàm l−ợng As trong mẫu, tính bằn ppb.
- Am: Độ hấp thụ của dung dịch mẫu, tính bằng ABS. - Ac: Độ hấp thụ của dung dịch chuẩn, tính bằng ABS. - Cc: Nồng độ dung dịch chuẩn, tính bằng ppb.
- m: Trọng l−ợng mẫu dùng để phân tích, tính bằng g.
- V0: Thể tích dung dịch mẫu dùng để phân tích, tính bằng ml.
+. Xây dựng qui trình phân tích As trong mẫu cơm.
- Chuẩn bị mẫu.
Cân 2,5 g cơm đã đ−ợc nghiền nhỏ vào cốc Teflon có dung tích 100 ml, cho vào mẫu 10àl dung dịch As (III) 1 ppm. Tiến hành khảo sát quá trình vô cơ hóa mẫu bằng ph−ơng pháp −ớt.
- Khảo sát lựa chọn dung dịch vô cơ hóa.
Với 2,5 gram mẫu cơm đã đ−ợc nghiền nhỏ cho lần l−ợt các dung dịch sau và trộn đều: - Dung dịch 1: 4 ml HNO3 + 1,5 ml H2O2. - Dung dịch 2: 4 ml HCl + 1,5 ml H2O2. - Dung dịch 3: 4 ml H2SO4 + 1,5 ml H2O2. - Dung dịch 4: 4 ml HNO3 + 2 ml H2SO4. - Dung dịch 5: 4 ml hỗn hợp HCl+HNO3 tỷ lệ 3:1.
Quá trình vô cơ hóa đ−ợc tiến hành trong lò vi sóng với cốc teflon kín, song song tiến hành với mẫu trắng.
- Khảo sát nhiệt độ và thời gian tiến hành vô cơ hóa. ảnh h−ởng của thời gian.
Sau khi có kết quả nghiên cứu dung dịch vô cơ hóa ta tiến hành khảo sát thời gian cần thiết để vô cơ hóa triệt để mẫu. Thời gian đ−ợc khảo sát từ 5-15 phút.
ảnh h−ởng của công suất lò vi sóng (nhiệt độ).
+. áp dụng qui trình tiến hành phân tích As trong một số mẫu môi tr−ờng thực tế.
Một số mẫu trong thực tế giám định đã đ−ợc chúng tôi tiến hành phân tích theo ph−ơng pháp này tại phòng thí nghiệm Hóa Pháp lí, Viện Khoa học Hình sự trong thời gian từ năm 2002 đến nay.
Phân tích asen bằng ph−ơng pháp biosensor
+ . Chuẩn bị hoá chất
Vi khuẩn E.Coli
- Lấy E.coli đông khô từ trong tủ lạnh, ổn định ở nhiệt độ phòng trong 5phút.
- Thêm 6,1ml đệm.
- Để 18giờ ở nhiệt độ phòng tr−ớc khi sử dụng. - Sử dụng trong ngày, không cần bảo quản.
Chất nền Luxiferin
- Thêm 6,1ml n−ớc tinh khiết vào lọ chứa chất nền Luxiferin. - ổn định tại nhiệt độ phòng trong 5phút.
- Sau khi pha, chất nền phải đ−ợc để trong bóng tối, tại nhiệt độ phòng và sử dụng trong vòng 8giờ sau khi pha.
Pha dung dịch chuẩn
Dung dịch chuẩn gốc: các dung dịch chuẩn gốc của Asen (III) và (V) 75ppm đ−ợc cung cấp kèm theo kit.
Dung dịch làm việc: Để có dung dịch As (III) và As (V) có các nồng độ nhỏ hơn, bằng cách pha loãng các dung dịch chuẩn gốc t−ơng ứng.
+. Lấy mẫu.
- Mẫu n−ớc tiểu:
Mẫu xét nghiệm là các mẫu n−ớc tiểu 24giờ. Mẫu đ−ợc phân tích ngay hoặc bảo quản ở 40C đến khi phân tích.
Mẫu n−ớc là các mẫu n−ớc mặt đ−ợc phân tích tích ngay hoặc bảo quản ở 40C đến khi phân tích.
+. Khảo sát khoảng tuyến tuyến, xây dựng đ−ờng chuẩn ngoại suy định l−ợng asen và xác định độ chính xác của ph−ơng pháp.
- Khảo sát khoảng tuyến tính của ph−ơng pháp.
Khoảng tuyến tính đ−ợc khảo sát với các dung dịch có độ pha loãng khác nhau từ dung dịch gốc, theo dõi c−ờng độ phát sáng của các dung dịch.
- Xây dựng đ−ờng chuẩn.
Dựa vào kết quả nghiên cứu thực nghiệm xác định khoảng tuyến tính của ph−ơng pháp ở trên, đ−ờng chuẩn đ−ợc xây dựng với các dung dịch có nồng độ nằm trong khoảng tuyến tính.
- Xác định độ chính xác của ph−ơng pháp.
Xác định độ chính xác của ph−ơng pháp đ−ợc tiến hành bằng cách định l−ợng các dung dịch có các l−ợng asen chính xác đ−ợc thêm vào.
Đánh giá sai số của ph−ơng pháp.
Chúng tôi chọn 05 cấp nồng độ khác nhau nằm trong khoảng tuyến tính của đ−ờng chuẩn, mỗi cấp nồng độ lặp lại 05 lần. các kết quả thí nghiệm đ−ợc xử lí theo ph−ơng pháp thống kê.
+. Tính kết quả
- Định tính
Để định tính xác định sự có mặt của asen trong mẫu, kết quả đ−ợc tính theo công thức sau:
n i L L K = (*)
Trong đó: K: hệ số quy nạp của mẫu
Kết quả mẫu d−ơng tính (có asen) khi K > 2.
- Định l−ợng
Hàm l−ợng asen đ−ợc tính theo ph−ơng trình hồi quy tuyến tính. Phải lập các đ−ờng chuẩn riêng ứng với mỗi bộ kit khác nhau.
+. Khảo sát hiệu suất thu hồi của kỹ thuật phân tích As trong mẫu n−ớc
Mẫu thu hồi đ−ợc tiến hành bằng cách thêm các l−ợng mẫu chuẩn xác định khác nhau vào nều mẫu n−ớc đã đ−ợc xác định không có asen, rồi tiến hành phân tích nh− quy trình.
+. Khảo sát hiệu suất thu hồi của kỹ thuật phân tích As trong mẫu n−ớc tiểu
Mẫu thu hồi đ−ợc tiến hành bằng cách thêm các l−ợng mẫu chuẩn xác định khác nhau vào nều mẫu n−ớc tiểu đã đ−ợc xác định không có asen, rồi tiến hành phân tích nh− quy trình.
+. Xử lý chất thải
- Tất cả các mẫu có chứa asen phải đ−ợc thu gom và xử lý thích hợp. - Các chất thải chứa vi khuẩn phải đ−ợc tiệt trùng bằng nồi hấp, bất hoạt vi
khuẩn bằng cách dùng cloramin B 10%.
+. Khảo sát một số mẫu thực tế
-Mẫu n−ớc tiểu (Nghiên cứu invivo)
Thỏ có trọng l−ợng: 2kg + 0,2kg. Tr−ớc và sau nhiễm độc, thỏ đ−ợc nuôi