+. Pha dung dịch chuẩn
Dung dịch chuẩn gốc đơn của mỗi chất đ−ợc pha bằng cách cân 10mg chất chuẩn cho vào bình định mức 10 ml dùng aceton định mức tới vạch (nồng độ 1000 ppm).
Hỗn hợp dung dịch chuẩn thực nghiệm với các nồng độ 10 ppm và 20 ppm đ−ợc pha từ dung dịch chuẩn gốc đơn của mỗi chất nh− sau: lấy 100 àl mỗi dung dịch chuẩn gốc đơn của các chất sau: diclovos; dimethroat; atrarin; cacbaryl; simarin; metolaclo; fenthion; parathion; clopyriphos; metylparathion và lấy 200àl của diuron; diazinon; malathion và fenitrothion vào bình định mức 10ml thêm etyl axetat đến vạch chuẩn
+. Chuẩn bị cột chiết.
1,5g nhựa XAD-4 (Merck) đ−ợc nhồi đầy các cột nhồi là các ống plastic của Supelco có thể tích 6ml. Đặt các miếng lót bông thuỷ tinh lên phía trên và phía d−ới lớp hấp phụ.
+. Thu mẫu:
Mẫu huyết thanh:
Lấy 10 ml máu không chống đông, tiến hành ly tâm 10.000vòng/phút trong 5 phút thu huyết thanh.
Mẫu huyết thanh đ−ợc phân tích ngay hoặc bảo quản 2ữ80C cho đến khi phân tích.
Mẫu n−ớc tiểu:
Lấy 100 ml n−ớc tiểu không sử dụng chất bảo quản, tiến hành ly tâm 4000vòng/phút trong 5 phút loại bỏ cắn
Mẫu đ−ợc phân tích ngay hoặc bảo quản 2ữ80C cho đến khi phân tích.
+. Chuẩn bị mẫu và chiết.
- Mẫu huyết thanh: 5ml đ−ợc hoà loãng bằng 5ml n−ớc cất, khuấy nhẹ bằng đũa thuỷ tinh, để ổn định tại nhiệt độ phòng trong 60phút. Mẫu đ−ợc đ−a lên cột chiết và để chảy tự nhiên cho đến hết, tráng cột bằng 5 ml n−ớc cất. Dùng bơm chân không hút khô cột trong thời gian khoảng 20 phút. Sau đó dùng các hệ dung môi để rửa giải.
- Mẫu n−ớc tiểu: 50ml đ−ợc đ−a lên cột chiết và để chảy tự nhiên cho đến hết, tráng cột bằng 5 ml n−ớc cất. Dùng bơm chân không hút khô cột trong thời gian khoảng 20 phút. Sau đó dùng các hệ dung môi để rửa giải.
+. Rửa giải.
Dùng 2 ml methanol để rửa ban đầu, và dùng tiếp 9 ml acetonitrin, phần dịch rửa đ−ợc hứng vào ống nghiệm .
+ Cô mẫu.
Phần dung môi thu đ−ợc đ−ợc đặt trong bể ổn nhiệt 380C d−ới dòng khí nitơ nhẹ để đuổi dung môi đến thể tích còn 500àl rồi định l−ợng bằng máy GC- MS.
+. Các khảo sát hiệu suất thu hồi của quy trình.
Các mẫu huyết thanh của quá trình khảo sát đ−ợc chuẩn bị bằng cách lấy 5ml huyết thanh hoặc 50ml n−ớc tiểu đ−ợc thêm 200àl hỗn hợp chuẩn thực nghiệm. Lắc kỹ trong 1phút để ổn định trong 10 phút và thực hiện nh− trong quy trình
+. Cách tính kết quả
Thời gian l−u và các ion mảnh đặc tr−ng của các cấu tử đ−ợc sử dụng để nhận diện bằng cách so sánh với thời gian l−u và các số khối của các ion mảnh đặc tr−ng của các cấu tử xác định để nhận diệm với chất chuẩn.
- Định l−ợng.
Nồng độ của HCBVTV trong mẫu n−ớc đ−ợc tính theo công thức:
V V V C ppm C( )= xì 2 Trong đó:
Cx: là hàm l−ợng của HCBVTV đ−ợc tính theo ph−ơng trình hồi quy tuyến tính của phần mềm kèm theo thiết bị GC-MS theo ph−ơng pháp nội chuẩn V1: Thể tích mẫu đem phân tích (ml)
V2: thể tích mẫu cuối (ml).
+. Điều kiện phân tích đa d− l−ợng các HCBVTV trên GC-MS.
Để đảm bảo các kết quả phân tích đ−ợc chính xác, cần tiến hành tối −u hóa điều kiện phân tích trên GC-MS. Đầu tiên thiết bị MS đ−ợc đặt ở chế SCAN để xác định về mặt định tính và thời gian l−u trên cột. Điều kiện chạy tối −u của máy GC-MS để phân tích các HCBVTV trong nghiên cứu đ−ợc thể hiện ở bảng 2.4 đ−ợc trình bày sau đây:
Bảng 2.4: Các thông số tối −u cho quá trình phân tích đa d− l−ợng các HCBVTV trong nghiên cứu các mẫu sinh học.
STT Thông số Số đo
1 Cột mao quản DB-5 Pha tĩnh: 5% phenyl-95% methylpolysiloxan
2 Chiều dài cột 30 m 3 Đ−ờng kính cột 0,25 mm 4 Nhiệt độ injector 250 0C Tăng nhiệt độ (0C/phút) Nhiệt độ (0C)
Thời gian giữ (Phút) 67 1 8 210 10 25 280 15 5 Nhiệt độ cột Tổng thời gian 36,76 phút 6 Nhiệt độ detector 280 0C 7 áp suất cột 93,7 kPa 8 Tốc độ dòng 1 ml/phút 9 Chế độ bơm Splitless 2.3.4 Phân tích HCBVTV bằng REMIDi HS
REMIDi HS (Rapid Emgency Drug indentification) là một loại thiết bị có khả năng nhận dạng, phân tích nhanh với độ nhạy cao và khả năng sàng lọc diện rộng. Máy có thể phát hiện nhiều loại chất cùng các chất chuyển hoá của trong cơ thể chỉ bằng một lần xét nghiệm duy nhất. Nhờ vào chức năng sàng lọc này nên có thể phát hiện đ−ợc nhiều loại hoạt chất mà không cần có sự dự đoán tr−ớc.
+. Lập th− viện nhận dạng các HCBVTV lân hữu cơ
Các HCBVTV lân hữu cơ th−ờng đ−ợc sử dụng trong nông nghiệp, đ−ợc khảo sát trong các mẫu n−ớc và mẫu n−ớc tiểu và huyết thanh với nồng độ 10ppm. Các mẫu này đ−ợc bơm vào thiết bị REMIDi HS để kiểm tra và lập th−
+. Khảo sát khả năng nhận dạng các hoá chất bảo vệ thực vật:
1ml mẫu huyết thanh và 1ml mẫu n−ớc tiểu sạch (và đ−ợc kiểm tra nh− là mẫu đối chứng) đ−ợc thêm từng HCBVTV với nồng độ từ 10ppm đ−ợc đ−a lên thiết bị REMIDi HS để khảo sát khả năng nhận dạng của thiết bị.
+. Khảo sát ng−ỡng phát hiện của thiết bị.
1ml mẫu huyết thanh và 1ml mẫu n−ớc tiểu đ−ợc thêm từng HCBVTV đ−ợc nghiên cứu với nồng độ xác định đ−ợc đ−a lên thiết bị REMIDi HS để khảo sát giới hạn phát hiện.
+. Khảo sát khả năng nhận dạng hỗn hợp HCBVTV
1ml n−ớc cất, 1ml mẫu huyết thanh và 1ml mẫu n−ớc tiểu đ−ợc thêm hỗn hợp HCBVTV đ−ợc nghiên cứu với nồng độ 10ppm đ−a lên thiết bị REMIDi HS để khảo sát khả năng nhận dạng hỗn hợp của thiết bị.