CHƯƠNG 2: CÁC PHƯƠNG PHÁP SẢN XUẤT COLLAGEN
2.1.5 Qui trình tách chiết Collagen từ phụ phẩm da, xương, vây của các loài cá ngừ ngừ ( Katsuwonus Pelamis), cá Pecca Nhật Bản ( Lacteolabrax japonias), cá Thu (Samber
( Katsuwonus Pelamis), cá Pecca Nhật Bản ( Lacteolabrax japonias), cá Thu (Samber japonus), cá Tráp Vàng( Dentex tumifrons), cá Mập ( Heterodonus japonius).
SVTH: VÕ THỊ HỒNG LINH Trang 44 Collagen sạch NaOH Da cá Loại tạp chất Loại tạp chất Chiết Ly tâm Butyl alcohol Acid acetic 0.5M Ly tâm Kết tủa Thẩm tích
Sấy thăng hoa NaCl Màng Cellophan Nước bẩn Bã Nước
ĐAMH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM GVHD: TS. PHAN NGỌC HÒA
Thuyết minh qui trình công nghệ :
Da, xương, và vây được bảo quản ở 25oC đến khi sử dụng. Tất cả quá trình tiền xử lý đến tách chiết đều tiến hành ở 4oC.
- Mục đích: quá trình loại tạp chất nhằm mục đích loại đi các chất non-
collagen ( chất béo, chất màu, chất gây mùi tanh,...) để chuẩn bị cho các quá trình tiếp theo. - Các biến đổi của nguyên liệu: da cá có quá trình hút nước, trương nở, lúc này trọng lượng của da cá tăng lên.
- Thiết bị và thông số công nghệ : lần loại tạp chất đầu tiên, ta tiến hành xử lý bằng dung dịch NaOH 1%, sau đó da cá được cho xử lý tiếp với dung dịch Butyl alcohol 10% để loại tiếp tạp chất.
Sau quá trình loại tạp chất, collagen được tách chiết bằng dung dịch acid acetic 0.5M trong 3 ngày. Quá trình chiết collagen được thực hiện trong các bình reactor ở nhiệt độ
lạnh, trong điều kiện vô trùng, khuấy trộn liên tục để đảm bảo chiết được collagen có chất lượng tốt. Sau quá trình chiết collagen ta tiến hành ly tâm thu lấy phần dịch, cả hai phần dịch chiết thu được là dung dịch lỏng, hơi sánh gọi là acid-soluble collagen. Phần bã thu được cũng được chiết lần hai với dung dịch aid acetic 0.5M trong vòng 2-3 ngày.
Để kết tinh collagen, cho NaCl sẵn vào dịch chiết đến nồng độ 0.9M. Đến đây collagen thô đã được kết tủa. Để thu được collagen sạch, ta tiến hành ly tâm, lấy phần tủa hòa tan vào dung dịch acid acetic 0.5M. Tiến hành thẩm tích thu được collagen sạch. Collagen sạch được làm lạnh và bảo quản ở nhiệt độ lạnh.
Trong quá trình tách chiết và tinh sạch protein, để loại muối ra khỏi dung dịch protein thi dung dịch protein được cho vào các túi đặc hiệu làm bằng nguyên liệu bán thấm, thường là dùng các túi cellophan. Sau đó đặt cả túi vào bình chứa lượng lớn, H20 hay lượng lớn dung dịch đệm được pha loãng ( có thể dùng đệm phosphat có pH = 7, nồng độ 0.01M). Vì màng cellophan là màng bán thấm có kích thước lỗ chỉ cho các chất có trọng lượng phân tử nhỏ đi qua các dung dịch đệm loãng. Như vậy, muối sẽ khuếch tán vào nước hoặc dung dịch đệm loãng ( di chuyển theo hướng giảm nồng độ), còn nước hay dung dịch đệm loãng sẽ di chuyển từ dung dịch rửa vào túi chứa protein. Protein là những đại phân tử không thể vượt qua túi thẩm tích và được giữ lại trong túi.
Sau khi tiến hành thẩm tích ta thực hiện ly tâm collagen vừa thu được, sau đó tiến hành sấy thăng hoa để thu được sản phẩm :
- Các biến đổi nguyên liệu: tách nước khỏi vật liệu bằng cách biến nước trong vật liệu thành đá, sau đó biến nước đá thành hơi nước mà không qua trạng thái lỏng. - Thiết bị: Hệ thống sấy thăng hoa tuần hoàn
* Hạ nhiệt độ sản phẩm sấy xuống dưới điểm đông lạnh (-10oC÷-20oC) và được đặt trong bình chân không có áp suất gần với áp suất chân không tuyệt đối, khi đó nước thoát ra khỏi sản phẩm sấy ở trạng thái rắn, tức là thăng hoa ẩm.
* Mô hình hệ thống thiết bị sấy thăng hoa gồm 5 bộ phận: bình thăng
hoa, bình ngưng của máy lạnh, máy nén của máy lạnh, bình ngưng-đóng băng, bơm chân không. Quá trình sấy thăng hoa gồm 3 giai đoạn: giai đoạn đông lạnh, giai đoạn thăng hoa và giai đoạn sấy ẩm dư. Sấy thăng hoa có ưu điểm giảm thời gian sấy xuống 3 lần, không ảnh hưởng lớn đến giá trị dinh dưỡng và mùi vị sản phẩm, tuy nhiên chi phí năng lượng riêng cao hơn các phương pháp khác khoảng 50-60%.
Hình 2.1 sơ đồ làm việc thiết bị sấy thăng hoa
Những kết quả phân tích collagen trích chiết từ da cá
Về hiệu suất tách chiết: đạt được hiệu suất tương đối cao 51,4% (cá pecca Nhật Bản), 49,8% (cá thu), 50,1% (cá mập) tính trên trọng lượng khô.
Hình 2.2 Sắc kí điện di SDS-PAGE collagen loại I của da heo và collagen da cá. (Điện di trên 3,5% gel chứa urea 3,5M: (A) Da heo; (B) Cá Pecca; (C) Cá mập; (D) Cá thu
Bằng phương pháp điện di như đã nói trên, hình 2.2 cho thấy collagen da của cá pecca và cá mập gồm 2 chuỗi α khác nhau, đó là α1 và α2. Trong đó, α2 có hàm lượng rất nhỏ. Nếu có α3 tồn tại thì cũng không thể tách khỏi α1 trong điều kiện điện di này. Còn đối với cá thu, collagen dạng α chỉ gồm chuỗi α1 mà hoàn toàn không có α2. Trong hình 2.2 ta cũng thấy có sự tồn tại của chuỗi β ở cả 3 loài cá.
Trong nghiên cứu này, tác giả đã sử dụng phương pháp điện di SPS-PAGE theo phương pháp của Weber và Osborn ( 1969) để xác định chuỗi collagen. Trong đó chuỗi collagen được hòa tan vào Sodium photphat 0.02M ( pH = 7.2) chứa 1% Sodium dodecyl sunphat ( SDS) và 3.5 ure. Tiến hành điện di trên 3.5% gel với đệm photphate 0.1M (pH = 7.2) chứa 1% SDS. Tác giả đã đo nhiệt độ biến tính của hỗn hợp collagen 0.03% hòa tan vào acid acetic 0.1M tại một số nhiệt độ. - Nhiệt độ biến tính collagen của da cá rất thấp : 26.5oC ( cá Pecca), 25.6oC(cá thu), 25oC (cá mập), thấp hơn khoảng 10 oC so với collagen của da cá heo ( 37oC).
Nhìn chung, tác giả đã đưa ra phương pháp tách chiết đơn giản, dễ thực hiện, chỉ là tách chiết dựa trên các hoá chất thông dụng, không quá đắt tiền, các thiết bị cũng thông dụng trong phòng thí nghiệm. Tác giả cũng khảo sát được cấu trúc chuỗi collagen gồm α1, α2, và α3. Khảo sát được nhiệt độ biến tính của collagen da cá và so sánh với collagen da heo. Tuy
nhiên cũng có một số nhược điểm là khi sử dụng butyl alcohol trong quá trình rửa da cá loại tạp chất, phải qua công đoạn chưng cất thu hồi dung môi. Butyl alcohol không được khuyến cáo sử dụng trong thực phẩm. Tác giả khảo sát cấu trúc collagen nhưng chưa xác định được trọng lượng phân tử của chúng, chưa xác định thành phần acid amin trong collagen.