VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM
6.1Biosensor phát hiện kim loại nặng dựa vào tính ức chế enzyme
Kim loại nặng được biết đến như chất ức chế hoạt tính enzyme. Cơ chế ức chế enzyme dựa vào sự tương tác giữa ion kim loại với nhóm thiol hay methylthiol của amino acid – được xem là vùng hoạt động của enzyme. Các kim loại có tác dụng ức chế mạnh nhất: thủy ngân, đồng và bạc.Người ta có thể áp dụng hiện tượng này để xác định các yếu tố độc hại. Đa số các detector sử dụng trong phương pháp ức chế enzyme có thể rất nhạy do hiệu ứng khuếch đại cation. Hơn nữa, enzyme thường đặc hiệu đối với chất ức chế và trong nhiều trường hợp tác dụng ức chế của chất phân tích có liên quan đến tính độ độc sinh học của nó.
Biosensor để phân tích thủy ngân được chú ý nhiều nhất do độc tính mạnh của Hg đối với con người. Có rất nhiều enzyme được dùng để dò tìm thủy ngân dạng vết như peroxydase [43][44], xanthine oxidase [45], invertase [46][47][48], glucose oxidase [49], butylcholinesterase [50], hay isocitric dehydrogenase [51] nhưng ứng dụng nhiều nhất là urease do nó rẻ, dễ thực hiện, có độ nhạy cao (Theo Viatcheslav Volotovsky và cộng sự – 1997). Biosensor sử dụng enzyme urease có thể sử dụng transducer đo quang, đo độ dẫn điện, đo điện dung. Phổ biến nhất là sử dụng transducer đo quang với màng enzyme phủ trên pH-ISFET (pH – ion sensitive field effect transitor), trên iridium oxide [52] hay polypyrole, hoặc điện cực screen-print.
Sau đây sẽ giới thiệu một loại biosensor để phát hiện thủy ngân và những kim loại nặng khác dựa trên cơ sở đo sự ức chế của chúng đối với enzyme urease.
Cấu tạo biosensor: urease được cố định trong màng PVC, gắn lên đầu cảm ứng pH của biosensor đo điện thế Ir:IrO2. Phương pháp cố định: ngâm điện cực Ir:IrO2 vào dung dịch chứa urease, PVC, Tetrahydrofurane; rồi làm khô ở nhiệt độ phòng [52].
Hình 6. 1: Cấu tạo urea biosensor với urease; 1-điện cực Pt; 2-ống PTFE; 3-mối hàn; 4- màng iridium oxide; 5-điện cực iridium; 6-màng polymer – urease .
Nguyên tắc hoạt động:
Biosensor sẽ được cho tiếp xúc dung dịch cơ chất (urea) dung dịch đệm có nồng độ biết trước. Đo tín hiệu thu được (Eo). Sau đó cho biosensor tiếp xúc với dung dịch chứa kim loại nặng trong một khoảng thời gian, rồi lại cho biosensor ngâm trong dung dịch cơ chất có cùng nồng độ như trên, đọc tín hiệu thu được (Ei). Từ 2 giá trị Eo và Ei, ta suy ra được phần trăm ức chế I%:
% o i 100
o
E E
E
I x
Từ I%, ta đem so sánh với đường chuẩn, sẽ ra được nồng độ tương ứng. Phảnứng xảy ra:
Thông số kĩ thuật:
Giữa các lần đo nên ngâm trong dung dịch bảo quản trong 10 phút (dung dịch bảo quản 0,1 M Tris-HCl (pH 7) với 10 mM EDTA và 10 mM thioacetamide)
Thời gian đáp ứng của điện cực là khoảng 2 phút.
Dung dịch cơ chất urea: 1mM trong 5ml Tris–HCl, pH 7. Nhiệt độ phân tích: 40oC.
Thời gian phân tích phụ thuộc vào bề dày của màng enzyme, nhưng theo kinh nghiệm thường tổng thời gian phân tích nhỏ hơn 20 phút.
Kết quả cho thấy: urease bị vô hoạt với 0,1 µM Ag(I); 0.02 µM Hg(II), hay 1 µM Cu(II). Để urease-based biosensor chỉ nhạy với ion thủy ngân, ta nên cho thêm vào mẫu 1 lượng NaI (100 µM) để khử độ nhạy với ion Ag (ion I sẽ tạo với ion Ag muối không tan hay tan ít), và rửa cảm biến trong 100 mM dung dịch EDTA trong 5 phút để rửa trôi ion Cu. Ta có thể tái hoạt hóa enzyme sau khi bị thủy ngân ức chế bằng cách rửa bằng 300mM dung dịch NaI trong 5 phút (đến 95 – 100% hoạt tính ban đầu). Enzyme cố định có độ nhạy cao đối với chất ức chế hơn là enzyme tự do.
Do quá trình ức chế của thủy ngân đối với enzyme urease không đặc hiệu, độ chọn lọc kém nên biosensor này chủ yếu dùng để xác định tổng hàm lượng kim loại nặng trong mẫu nước.
urease