VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM
3.2 Biosensor áp điện
Đây là phương pháp khá đơn giản và hiệu quả mà lại tốn rất ít chi phí.
Cấu tạo biosensor gồm có tinh thể thạch anh được phủ điện cực vàng, trên điện cực vàng được gắn kháng thể kháng vi sinh vật cần xác định.
Nguyên tắc của phương pháp áp điện là: khi chất cần phân tích kết hợp với bioreptor của transducer (thường là kháng thể) thì khối lượng trên cảm biến sẽ tăng, trong khi tần số dao động của nó lại giảm xuống tương ứng, bằng cách xác định tỷ lệ giảm tần số dao động của tinh thể áp điện, ta có thể xác định được nồng độ vi sinh vật. Phương pháp này là sự kết hợp độ nhạy của vi cân bằng tinh thể thạch anh với tính đặc hiệu của kháng thể.
Hình 3. 7: Nguyên tắc hoạt động của biosensor áp điện
Cách thực hiện phép đo trong biosensor áp điện:
Sau khi chuẩn bị cố định được kháng thể cần thiết lên tinh thể có phủ điện cực vàng, người ta kẹp tinh thể giữa 2 dây kim loại, nối với máy tạo dao động, máy đếm tần số. Đầu tiên ta đo được tần số dao động cơ bản của tinh thể là F1, và sau đó tinh thể ngâm trong mẫu chứa tế bào vi khuẩn trong một khoảng thời gian ở nhiệt độ phòng, tiếp tục tinh thể được rửa với đệm phosphate và làm khô ngoài không khí; đo tiếp tần số tinh thể thay đổi do tế bào vi khuẩn gắn lên bề mặt tinh thể được đo là F2 [19].
Tinh thể không gắn kháng thể (được gọi là tinh thể so sánh)cũng được đo tương tự. Tần số giảm: Fs = F1s – F2s đối với tinh thể có gắn kháng thể, Fr = F1r – F2r đối với tinh thể so sánh. Tần số thay đổi của tinh thể so sánh Fr < 3Hz. Tần số thực độ giảm F =
Fs - Fr; và tần số giảm trung bình của 3 tinh thể có quan hệ với nồng độ tế bào vi khuẩn, thông qua công thức của Sauerbrey như sau:
F = - 2,26 x 10-6 F2 m/A
trong đó F là độ giảm tần số, F: tần số cộng hưởng (tùy thuộc vào tinh thể sử dụng), m là độ chênh lệch khối lượng, A: diện tích bề mặt điện cực.
Biosensor áp điện đã được dùng rộng rãi để dò tìm Candida albacans (Muramatsu và cộng sự., 1986), Salmonella typhimurium (Prusak Sochaczewski và cộng sự, 1990),
Listeria monocytogenes (Jacobs và cộng sự.,1995), Vibrio cholerrae (Cater và cộng sự., 1995), và họ Enterobacteriaceae (Plomer và cộng sự., 1992) [2].
Biosensor áp điện của Prusak – Sochaczewski và cộng sự., 1990 được dùng để xác định S. Typhimurium. Kháng thể phải chọn lọc được kháng nguyên cần phân tích trong khi có nhiều loài Salmonella cùng tồn tại. Cảm biến có thể detect được S.typhimurium
trong khoảng 105 – 109 tế bào/ml. Thời gian đạt được tín hiệu ổn định phụ thuộc vào nồng độ tế bào như với thời gian 5h, ta có thể detect được 105 tế bào/ml S.typhimurium. Độ bền của cảm biến chỉ giữ được qua khoảng 6 – 7 thi nghiệm. Để tái sử dụng, tế bào cần được loại bỏ khỏi tinh thể bằng cách rửa với dung dịch 8M urea [17].
Koenig và Gratzel, 1993a,b cũng nghiên cứu được biosensor tương tự như vậy để phát hiện Salmonella, E.coli, Yersinia pestis và Shigella dysenteriae. Ủ cảm biến với mẫu chứa vi khuẩn trong 45 phút, rửa bằng dung dịch đệm phosphate và làm khô ngoài không khí, sau đó đo sự thay đổi tần số. Vùng tuyến tính của cảm biến này là 106 – 108 tế bào/ ml. Nó có thể được tái sử dụng 12 lần [17].
Biosensor áp điện cũng được ứng dụng để detect các loài vi khuẩn đường ruột trong nước uống. Tinh thể cũng được phủ điện cực vàng và kháng thể kháng vi khuẩn đường ruột. Biosensor được nhúng trong dung dịch chứa vi khuẩn khoảng 40 phút, rửa sạch và làm khô rồi đo tần số dao động. Kết quả tuyến tính trong khoảng 106 – 109 tế bào/ml [17].
Ngoài kỹ thuật “ngâm và làm khô” như trên, người ta cũng có thể gắn biosensor vào hệ thống FIA để giảm thời gian đáp ứng, không cần làm khô, cho kết quả trực tiếp về độ lệch tần số. Ví dụ của hệ thống này trong trường hợp detect S. typhimurium [19]: kháng thể kháng Salmonella được cố định lên điện cực vàng qua kỹ thuật polyethylenimine-glutaraldehyde (PEG), tốc độ dòng dung dịch đệm phosphate (chất mang) (pH 7.0) là 0,15 ml/phút, thời gian phản ứng là 25 phút (khoảng thời gian ngừng để kháng thể cố định và tế bào S.typhimurium tương tác mạnh nhất, nếu dài hơn thì độ chênh lệch tần số vẫn không đổi), mẫu được tiêm vào với thể tích 60 µl (để đạt tín hiệu ra lớn nhất). Với điều kiện hoạt động như vậy, biosensor cho kết quả tuyến tính trong khoảng 5,3 x 105 tới 1,2 x 109 cfu/ml, tương ứng với độ lệch tần số là 23 – 47Hz.
Hình 3. 8: Hệ thống FIA với biosensor áp điện
Bảng 3. 1: So sánh giữa các phương pháp dò tìm S.typhimurium [19]
Phương pháp phân tích Thời gian phân tích Độ nhạy (cfu/ml) ELISA PCR Biosensor áp điện Giờ Giờ Phút 104 – 105 103 – 104 105
Từ bảng trên, ta thấy biosensor có độ nhạy tương đương với các phương pháp truyền thống khác nhưng thời gian phân tích lại ngắn hơn rất nhiều (chỉ vài phút) nên biosensor áp điện có thể được coi là một phương pháp detect nhanh và hiệu quả, không cần qua nhiều bước chuẩn bị phức tạp, nó có thể chế tạo dạng nhỏ gọn, cầm tay có thể đem phân tích ở bất kỳ nơi nào.