VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM
3.1Biosensor quang
Biosensor này có độ chọn lọc và độ nhạy cao. Nó đã được dùng để phát hiện nhanh nhiều chất gây nhiễm (Willardon và cộng sự, 1998; Tschemelak và cộng sự; 2004), chất độc hay chất ảnh hưởng thần kinh (Bae và cộng sự, 2004) và cả vi sinh vật gây bệnh (Baeumer và cộng sự, 2003). Gần đây, hiện tượng phát huỳnh quang và cộng hưởng plasmon bề mặt (surface plasmon resonance, SPR) đã được áp dụng trong biosensor phân tích vi sinh vật.
Biosensor dựa trên hiện tượng cộng hưởng plasmon bề mặt
Nguyên tắc của hiện tượng cộng hưởng plasmon bề mặt:
Một hiện tượng quang học xảy ra giữa 2 môi trường trong suốt có chỉ số khúc xạ khác nhau: Tia sáng đi từ môi trường có chỉ số khúc xạ cao hơn sẽ bị phản xạ một phần và khúc xạ một phần, nhưng khi góc tới lớn hơn góc giới hạn thì không có tia sáng nào bị khúc xạ, đó là hiện tượng phản xạ toàn phần. Tuy nhiên, một thành phần của ánh sáng, sóng tắt dần (evanescent wave), sẽ truyền qua môi trường có chỉ số khúc xạ thấp hơn và nếu bề mặt tiếp xúc giữa 2 môi trường có phủ màng kim loại mỏng (ví dụ vàng), sóng tắt dần sẽ tương tác với sóng plasom đi trên bề mặt kim loại (ở phía mặt kim loại không tiếp
xúc với cơ chất thủy tinh), do đó năng lượng ánh sáng tới coi như bị “mất” đi trong kim loại và cường độ ánh sáng phản xạ sẽ giảm. Góc tới (có giá trị lớn hơ góc tới hạn) làm cho sự mất năng lượng là lớn nhất và cường độ của ánh sáng phản xạ là nhỏ nhất thì góc đó gọi là góc cộng hưởng bề mặt θspr và hiện tượng đó được gọi là hiện tượng cộng hưởng bề mặt plasmon [27].
Hình 3. 1: Nguyên lý cấu tạo biosensor SPR (của Biacore)
Thiết bị cộng hưởng bề mặt plasmon SPR được cung cấp sẵn từ nhiều nguồn sản xuất. Khoảng 90% tất cả các thiết bị SPR trong lĩnh vực biosensor quang là từ Biacore. Khi sử dụng thiết bị SPR – Biacore, việc phân tích được thực hiện trong flow cell trên những chip cảm biến có thể thay thế được (do chip cảm biến của Biacore gồm nhiều loại, tùy từng trường hợp mà gắn những loại tương ứng vào). Để cấu tạo nên biosensor SPR, phần bioreceptor được cố định lên bề mặt cảm biến, bề mặt này gồm có lớp màng kim loại vàng phủ trên “vật chống đỡ” (support) thủy tinh. Bề mặt lại được phủ lớp dextran để tạo vùng liên kết đồng hóa trị với bioreceptor. Mẫu và dòng dung dịch đệm được vào thông qua integrated microfuidic cartridge (IFC). Phía trên bề mặt cảm biến (trái phía với flow cell là một lăng kính. Ánh sáng phân cực từ diode phát sáng (light-emmitting diode, LED) phản xạ trên thủy tinh và được phát hiện bằng cảm biến CCD (charge-coupled diode).
Trong Biacore, tương tác giữa phân tử tự do và phân tử cố định xảy ra trên bề mặt cảm biến. Do có sự liên kết trên bề mặt mà khối lượng của bề mặt sẽ tăng, do đó làm chỉ số khúc xạ thay đổi, ta có thể đo được giá trị này. Tín hiệu về sự thay đổi góc chuyển
cộng sự, 1991). Bằng cách dựng đồ thị của góc thay đổi theo thời gian, ta sẽ thấy được quá trình tương tác ở bề mặt cảm biến.
Hình 3. 2: Hệ thống Biacore
Gertie và cộng sự, 2003 [36] đã áp dụng biosensor SPR Biacore để phát hiện
Salmonella nhóm B, D và E trong thực phẩm. Trong biosensor này, kháng thể đơn dòng kháng Salmonellađược cố định lên bề mặt biosensor. Cho dòng dung dịch đệm HBS – EP pH 7,4 (10 mM 4-[2-hydroxyethyl]piperazine-1-ethane-sulfonic acid, 0,15 M sodium chloride, 3 mM EDTA and 0,005% v/v polysorbate 20) chảy qua flow cell với vận tốc 1 µl/phút trong vòng 160 giây. Dung dịch huyền phù mẫu chứa vi khuẩn (sau khi đã xử lý ở nhiệt độ 100oC trong 10 phút và làm nguội đến nhiệt độ phòng) được chuyển vào đĩa vi chuẩn (microtiter plate), đầu lấy mẫu tự động sẽ lấy mẫu trong đĩa này và bơm vào flow cell 10 µl mẫu, khi đó vi khuẩn sẽ bị kháng thể cố định giữ lại, làm thay đổi góc cộng hưởng tương ứng với nồng độ tế bào vi khuẩn. Sau 105 giây, bơm 50 µl/phút dung dịch đệm chứa kháng thể đa dòng kháng Salmonella trong 2 phút để tăng tín hiệu ở đầu ra (giống như tạo dạng sand-wich trong phương pháp ELISA). Thí nghiệm được tiến hành với 30 loài vi sinh vật khác Salmonella (ở 109 cfu/ml) nhưng tín hiệu ở đầu ra sai khác không đáng kể so với mẫu trắng. Tổng 53 Salmonella typ huyết thanh được phát hiện thành công với giới hạn dò tìm là 1 x 107 cfu/ml, trừ các typ A, C, G, L và P. Từ những kết quả đó, biosensor này có thể phát hiện được Salmonella nhóm B, D, E trong nước uống một cách đặc hiệu, độ nhạy cao, vận hành đơn giản và nhanh.
Ngoài Biacore đã mô tả ở trên, người ta còn sử dụng một loại thiết bị SPR khác, thiết bị Plasmonic® SPR [28, 29]. Saikat và cộng sự (2007) đã áp dụng thiết bị Plasmonic để phân tích Salmonella trong sữa. Thiết bị Plasmonic gồm một lăng kính thủy tinh phủ
kim loại vàng dày 50 nm. Nó được đặt bên dưới hệ thống cuvette có 8 kênh, đây là kênh để dẫn mẫu từ thiết bị hút mẫu tự động mà không cần hệ thống vi lỏng (micro-fluidic) như Biacore, ưu điểm của nó là không bị nghẹt mẫu trong ống, thể tích mẫu chỉ cần 10 µl. Nguồn sáng được phát ra từ diode laser (bước sóng 786 nm), nó đi qua thấu kính trụ để trở thành chùm tia phân kỳ, như thế ta có thể thu được toàn bộ tia tới và nhanh chóng xác định được góc cộng hưởng. Tia phản xạ được phát hiện bởi thiết bị cảm biến hình ảnh (charge coupled - CCD). Toàn bộ quá trình hoạt động xảy ra ở nhiệt độ 22oC được kiểm soát bởi hệ thống Peltier.
Hình 3. 3: Sơ đồ hệ thống thiết bị Plasmonic
Hình 3. 4: Cảm biến SPR đặt phía dưới hệ thống cuvette
Kháng thể đa dòng kháng Salmonella (250 µg/ml) được cố định lên bề mặt cảm biến. Sau đó rửa cảm biến bằng dung dịch đệm phosphate (PBS) để rửa những kháng thể không được cố định, và những chỗ trên bề mặt không có kháng thể sẽ được “khóa” bằng
đa dòng cố định sẽ bắt giữ typ huyết thanh Salmonella có trong mẫu (Salmonella Typhimurium và Salmonella Enteritidis). Vi khuẩn bị bắt giữ này lại được kết hợp với kháng thể đơn dòng đặc hiệu cho từng typ huyết thanh (O:4 đặc hiệu cho S. Typhimurium; O:9 đặc hiệu cho S. Enteritidis). Tín hiệu đầu ra là tín hiệu ổn định thu được sau khi rửa cảm biến bằng dòng dung dịch đệm phosphate, được thể hiện trên đồ thị cảm biến SPR với đơn vị AU (arbitrary unit).
Có 2 kiểu đưa dòng dung dịch chứa kháng thể đơn dòng: kiểu đa kênh (multi- channel) hay kiểu đơn kênh (single-channel).
Hình 3. 5: Nguyên lý dò tìm Salmonella theo 2 kiểu SPR với a: SPR đa kênh; b: SPR đơn
kênh. , : bề mặt điện cực vàng C18; : kháng
thể đa dòng; : O:4 Kháng thể đặc hiệu S.Typhimurium; : O:9 Kháng thể đặc hiệu S.Enteritidis.
Kiểu đa kênh: bơm hỗn hợp kháng thể đơn dòng O:4 và O:9 (tỷ lệ 1:1 v/v) vào cảm biến, O:4 và O:9 sẽ kết hợp đặc hiệu với S.Typhimurium và S.Enteritidis tương ứng. Theo nghiên cứu thì sự có mặt đồng thời 2 kháng thể đơn dòng không ảnh hưởng lẫn nhau về khả năng kết hợp với vi khuẩn. Kết quả phân tích này cho ta biết được tổng số Salmonella có được trong mẫu.
Kiểu đơn kênh: bơm lần lượt 2 kháng thể đơn dòng vào. Theo nghiên cứu cho thấy thì bơm O:4 hay bơm O:9 vào trước thì tín hiệu thu được sai lệch không đáng kể. Với phương pháp này, ta có thể biết được số tế bào S.Typhimurium cũng như S.Enteritidis.
Hình 3. 6: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi tín hiệu trong cảm biến; (a) Bơm O:4 vào trước rồi bơm O:9; (b) Bơm O:9 vào trước rồi bơm O:4
Biosensor với thiết bị Plasmonic đã được ứng dụng thành công khi phân tích đồng thời nhiều typ huyết thanh của Salmonella trong sữa (S.Typhimurium và S.Enteritidis) mà không cần chuẩn bị mẫu. Nó có tính đặc hiệu cao (do không có tín hiệu ở đầu ra khi thí nghiệm với mẫu chỉ chứa E.coli), nhanh (chỉ mất khoảng 1h để phân tích), thể tích mẫu chỉ cần 10 µl. Giới hạn dò tìm đối với Salmonella Typhimurium và Salmonella Enteritidis
lần lượt là 2,5 x 105 tế bào/ml và 2,5 x 108 tế bào/ml.
Ưu điểm của những phương pháp biosensor SPR như kể trên là nó có tính đặc hiệu cao, nhanh, tự động hóa được, nó giống với phương pháp ELISA ở chỗ tạo được dạng sandwich nhưng không cần bất cứ “nhãn” nào để đánh dấu, do đó nó đơn giản hơn, tiết kiệm thời gian hơn phương pháp ELISA, bề mặt cảm biến có thể được tái sinh dễ dàng và tái sử dụng khoảng 100 – 200 lần.